透明質酸生產中生物發酵工藝過程

姜暉

（恩宜琺瑪（天津）工程有限公司上海分公司，上海 200052）

透明質酸的生產工藝是典型的生物發酵及提取過程。其中，生物發酵復雜多變，并且直接影響到產品的產量和質量，對于生產過程至關重要，本文將對其著重介紹。

1 透明質酸

透明質酸（bHA）具有良好的保濕作用，其多用于制藥及化妝品，它的特點是保濕性受周圍環境的相對濕度影響較小。透明質酸在相對濕度較低時(33%)吸濕量相對最高，在相對濕度較高時(75%)吸濕量相對最低。這種獨特的性質適合不同季節、不同環境濕度(如干燥的冬季和潮濕的夏季)皮膚對化妝品保濕作用的要求。

透明質酸分子中含有大量的羧基和羥基，在水；溶液中形成分子內和分子間的氫鍵，這使其具有強大的保水作用，可結合自身400倍以上的水；在較高濃度時，由于其分子間作用形成的復雜的三級網狀結構，其水溶液又具有顯著的粘彈性。透明質酸作為細胞間基質的主要成分，直接參與細胞內外電解質交流的調控，發揮物理和分子信息的過濾器作用。大分子透明質酸對細胞移動、增殖、分化及吞噬功能有抑制作用，小分子透明質酸則有促進作用。

透明質酸可用作眼科人工晶體植入手術的粘彈劑、骨性關節炎和類風濕性關節炎等關節手術的填充劑，作為媒介在滴眼液中廣泛應用，還用于預防術后粘連和促進皮膚傷口的愈合。與其它藥物反應形成的化合物對藥物發揮緩釋作用，可達到定向和定時釋放的目的。隨著醫藥科技的發展，透明質酸在醫藥方面的應用將越來越廣泛。

2 透明質酸生產中的生物發酵

透明質酸生產中生物發酵簡單的工藝流程見圖1:

圖1

2.1 混料

混料罐用于進行原材料的預混，預混好的料將用于種子發酵工序或者主發酵工序?；炝瞎奘鞘謩硬僮?，原材料和溶液在混料罐中通過攪拌混勻以后通過泵轉移至下一級罐，而混料罐的在線清洗是通過在線清洗站自動控制來完成。混料罐的容積大小需根據產品產量來決定，混料的時間通常小于1h。

具體操作流程為：

1）將料斗安裝在罐口，另一端接到排風系統以防止粉塵散落到房間中。2）打開手動操作閥門通過觀察稱重傳感器加入一定量的純水在混料罐中。3）將裝有原材料的袋子通過叫料斗倒入混料罐。4）pH值按工藝需要調節到4～10。5）當原材料完全被倒入罐底以后，將攪拌器調整至高速。6）通過傳輸泵將混合好后的溶液轉移至種子發酵罐。7）混料罐溶液轉移完成以后需要通過在線清洗站做在線清洗，此時攪拌器轉速需要跳到低速，在線清洗可以將罐中殘留清洗干凈，以免對下一個批次產生污染及影響。

2.2 給料

給料罐用于準備蔗糖溶液，而后蔗糖溶液被轉移至種子發酵罐或者主發酵罐。通常給料罐包含兩個給料罐和一條轉移管道，目的是為了操作可以在循環模式下進行，以確保每一個罐都能通過一個循環。當一個罐里的蔗糖溶液用完以后，將會從轉移管道斷開，進行清洗、滅菌，再加入新的培養基溶液再次連接到轉移管道，從而形成一個循環。所有的操作均為手動操作，只有在線清洗為自動操作。

具體操作流程為：

1）通過手動閥門從轉移管道斷開給料罐，連接兩個給料罐通過特殊的截斷閥門，以保證不出現交叉污染。2）通過在線清洗站做在線清洗，此時攪拌器轉速需要跳到低速。在線清洗是為了確保罐里沒有上一批次溶液的殘留和污染。3）培養基準備：安裝手動料斗在罐口，另一端接到排風系統以防止粉塵散落到房間中。4）打開手動操作閥門通過觀察稱重傳感器加入一定量的純水在給料罐中。5）將裝有蔗糖的袋子通過叫料斗全部倒入給料罐中。6）給料罐通過蒸氣進行加熱。7）當蔗糖完全被傾倒入罐底以后，攪拌器需要調整至高速。8）關閉罐口，使給料罐可以進行滅菌。9）給料罐自動被潔凈蒸汽加熱到95℃，為了降低振動需要在潔凈蒸汽中混入一些空氣。10）繼續再加熱到滅菌溫度。11）保持在滅菌溫度下設定的滅菌時間。12）滅菌完成后由操作人員打開冷卻水，進行冷卻。13）冷卻到需求溫度后轉移至下一級發酵罐。

2.3 細胞培養

培養箱用于最初的細胞培養，是一個單獨的設備。細胞在錐形瓶中的培養基里面增長并且在恒溫恒濕的環境下，培養箱通過控制溫度達到細胞培養的最佳環境。因此培養箱內部溫度的恒定性驗證需要通過驗證儀來校驗合格。

2.4 種子發酵

種子發酵罐用于生物轉換糖和營養物質進入到產品中而進行生物發酵。營養液在種子發酵罐中進行滅菌，然后加入預滅菌的蔗糖溶液，在發酵罐被潔凈蒸汽冷凝水充滿之前，接種物質開始接種到種子發酵罐當中。種子發酵完成后形成的種子液體培養基將會轉移至相應的主發酵罐中進行進一步的發酵。

具體操作流程為：

1）培養基轉移。2）稱量電極已校驗，閥門已連接好。3）將混料罐和主發酵罐通過軟管連接好，將混料罐中的溶液轉移至主發酵罐當中達到規定的液位值。4）攪拌器調至一定轉速。5）確保儲罐，閥門達到可以滅菌狀態包括冷卻夾套和盤管的放凈。6）滅菌：過程分為三個階段：加熱排除空氣；加熱到95℃排除空氣；繼續加熱到121～125℃，保持滅菌一定時間。整個過程通過PLC來控制。7）冷卻：關閉蒸汽開啟潔凈空氣避免發酵罐壓力過大。8）壓力保持一定冷卻到控制的發酵溫度。9）消毒后pH值調整：消毒后通過加入磷酸來調整pH值4～9。10）接種之前加入維生素和NaOH。11）從給料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接種：將接種物質從罐口加入。13）發酵：保持合適的溫度20～45℃，攪拌速度，壓力0～1bar和空氣流量。14）接種轉移：通過輸送管道轉移至主發酵罐。15）在線清洗：接種液傳輸完畢，進行在線清洗，以防止交叉污染。

2.5 主發酵過程

主發酵過程與種子發酵過程相似。主發酵罐用于生物轉換糖和營養物質進入到產品中進行生物發酵。營養液在主發酵罐中進行滅菌，然后加入預滅菌的蔗糖溶液，在發酵罐被潔凈蒸汽冷凝水充滿之前，接種物質開始接種到主發酵罐當中。主發酵完成后形成的溶液轉移至下一步提取過程中。

具體操作流程為：

1）培養基轉移。2）稱量電極已校驗，閥門已連接好。3）將混料罐和主發酵罐通過軟管連接好，將混料罐中的溶液轉移至主發酵罐當中達到規定的液位值。4）攪拌器調至一定轉速。5）確保儲罐，閥門達到可以滅菌狀態包括冷卻夾套和盤管的放凈。6）滅菌，過程分為三個階段：加熱排除空氣；加熱到95℃排除空氣；繼續加熱到121～125℃，保持滅菌一定時間。整個過程通過PLC來控制。7）冷卻：關閉蒸汽開啟潔凈空氣避免發酵罐壓力過大。8）壓力保持一定冷卻到控制的發酵溫度。9）消毒后pH值調整：消毒后通過加入磷酸來調整pH值4～9。10）接種之前加入維生素和NaOH。11）從給料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接種：對種子罐到主發酵罐的傳輸管道滅菌。13）溶液從種子發酵罐轉移至主發酵罐。14）發酵：pH值通過NH3或者H3PO4控制。15）蔗糖的加入通過溶解氧來控制適宜的流量。16）泡沫監測器監測到泡沫需要手動加入止泡劑。17）保持合適的溫度20～45℃，攪拌速度，壓力0～1bar和空氣流量。18）收獲：收獲過程中主發酵罐通過潔凈空氣保持一定的壓力。19）將主發酵罐連接到下游提取相應的設備。20）在線清洗：接種液傳輸完畢，進行在線清洗，以防止交叉污染；在線清洗站自動完成主發酵罐的在線清洗。

3 結語

經過上述發酵過程，所得發酵液經過過濾、提取、干燥即可得到透明質酸粉末狀成品。整個工藝過程穩定可控，可根據具體產量要求放大或縮小生產規模。