Folin—Ciocalteu法測定昭通葡萄及其葡萄酒總酚含量

袁曉春 李輔碧

摘要 [目的] Folin-Ciocalteu法測定葡萄總酚含量，為昭通葡萄生產及其釀制工藝提供科學依據。[方法] 采用甲醇作溶劑，超聲提取葡萄總酚，以Folin-Ciocalteu試劑和50 g/L Na2CO3溶液處理，在765 nm處測其吸光度。 [結果] 以沒食子酸為標準，質量濃度在1～40 mg/L范圍內與吸光度線性關系良好（r=0.999 5）。平行測定（n=6）葡萄總酚含量，RSD在1.1%～1.6%，對葡萄和葡萄酒的加標回收率試驗結果分別為98.8%、98.3%，RSD依次為1.8%、2.0%。 [結論] 該法操作簡便，重復性好，結果準確可靠，可用于測定葡萄及葡萄酒中總酚含量。

關鍵詞 昭通葡萄;Folin-Ciocalteu法;測定;總酚

中圖分類號 S663.1 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）33-11859-02

Measure of Total Polyphenols Content in Zhaotong Grape and Grape Wine by Folin-Ciocalteu Method

YUAN Xiao-chun1， LI Fu-bi2 （1. Zhaotong University， Zhaotong，Yunnan 657000; 2. Food and Drug Inspection Office in Zhaotong City， Zhaotong， Yunnan 657000）

Abstract [Objective] In order to provide scientific basis for production and brewing of Vitis vinifera in Zhaotong， the total polyphenol content in grapes was measured by Folin-Ciocalteu method. [Method] Using methyl alcohol as the solvent， total polyphenols of Vitis vinifera was extracted by supersonic method， then added Folin-Ciocalteu reagent and 50 g/L Na2CO3 solution， and measured the absorbancy at 765 nm. [Result] Basing on gallic acid， the mass concentration had an obvious linear relation （r=0.999 5） with absorbancy within the scope of 1-40 mg/L. The parallel determination （n=6） of total polyphenol results were that， when RSD was between 1.1% to 1.6%， the adding standard recovery of Vitis vinifera and grapes wine were 98.8%， 98.3%， RSD 1.8%， 2.0%. [Conclusion] This method is convenient， repeatable and faithful， which can be used for determination of polyphenol in grapes and grape wine.

Key words Zhaotong grape; Folin-Ciocalteu assay; Determination; Total polyphenol

作者簡介 袁曉春（1968- ），女，云南威信人，講師，從事物質成分分析及其應用的研究。

收稿日期 2014-10-17

植物多酚（Plant polyphenol）又名植物單寧（Vegetable tannin），為植物體內的復雜酚類次生代謝物，具有多元酚結構，主要存在于植物的皮、根、葉、果中。植物多酚具有很強的抗氧化和清除自由基活性，水果、蔬菜、飲料等是植物多酚的主要來源[1]。因為果實汁多味美并含有豐富營養，而倍受人們青睞的葡萄[2]中就含有大量的多酚類物質。葡萄多酚是一種植物多酚類活性物質，能溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，它廣泛存在于葡萄籽、葡萄皮與果汁中。葡萄多酚由表兒茶酸等酚酸類、黃烷醇類、花色苷類、黃酮醇類和縮聚單寧等物質組成[3]。研究表明，葡萄中的多酚含量對葡萄酒的釀制影響很大。葡萄酒存放時多酚的各種化學反應將影響到葡萄酒的色澤、口感、品質。在葡萄酒釀制和葡萄多酚提取中，都要對多酚含量進行監控和測定。采用Folin-Ciocalteu法測定葡萄多酚具有很好的精密度和準確度[4]。

葡萄和葡萄酒中所含多酚可以消除人體內的自由基而起到抗氧化、抗腫瘤、抗癌、降血脂、預防動脈粥樣硬化和冠心病等保健作用，因而深受人們喜愛。生活在云南昭通的人們除了喜歡食用新鮮葡萄，好多家庭還在本土葡萄大量上市的時候，選擇新鮮葡萄自行釀制葡萄酒[5]。為此，筆者對昭通葡萄及其家釀葡萄酒進行采樣，通過超聲提取技術，采用Folin-Ciocalteu法測定其葡萄總酚量，以期為昭通葡萄的生產及其葡萄酒的釀制工藝提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料。從市場購進昭通本土出產的不同品種的新鮮葡萄，在不同家庭采集以昭通葡萄為原料的家釀葡萄酒。

1.1.2 主要試劑。

Folin-Ciocalteu試劑，上海荔達生物科技有限公司（分析純 20140806）;無水碳酸鈉，分析純，天津化學試劑三廠;甲醇，色譜純Fisher Scientific公司;沒食子酸標準品，中國食品藥品檢定研究院，110831-201204;水，超純水。

1.1.3 主要儀器。GZX-9246MBE數顯鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備;MS105DU電子天平，梅特勒-托利多公司; UC-7100S超聲波清洗器，美瑞泰克科技（天津）有限公司;TG16-WS臺式高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司; UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑的配制。

50.0 mg/L標準溶液：準確稱取5.0 mg沒食子酸標準品溶解于8.0 ml的甲醇中，并用超純水定容至100 ml（現配）。50 g/L Na2CO3溶液：稱取50.00 g無水Na2CO3，溶于超純水并定容至1 000 ml。80%甲醇溶液：量取80 ml 甲醇，加12 mol/L的鹽酸0.1 ml ，并用超純水稀釋定容至100 ml[6]。

1.2.2 試樣的準備。將2種新鮮葡萄的葡萄皮1號、2號，于40 ℃下烘80 min后冷卻備用。采集3個家庭以昭通葡萄為原料的家釀葡萄酒3號、4號、5號（釀制年份、保存條件不詳）。

1.2.3 顯色時間的確定。準確吸取50.0 mg/L沒食子酸標準溶液0.50 ml于25 ml比色管中，加入80%甲醇溶液0.50 ml、1.00 ml Folin-Ciocalteu試劑、50 g/L Na2CO3溶液8.00 ml，充分搖勻，在15、30、45、60 min處測其吸光度，在15～45 min的吸光度逐漸增大，45 min后吸光度有所降低。以此確定測定反應的顯色時間為45 min。

1.2.4 總酚的提取。準確稱取0.050 g已烘干的葡萄皮，置于5.0 ml 80% 甲醇溶液中，在40 ℃、40 kHz超聲提取40 min后，在4 000 r/min下離心20 min后分離出上層清液，同等條件下提取2次，合并提取液，用超純水稀釋并定容至100 ml。

對于家釀葡萄酒，直接吸取1.0 ml于100 ml容量瓶中，加8.0 ml 甲醇并用超純水定容。

2 結果與分析

2.1 工作曲線的繪制

準確吸取50.0 mg/L沒食子酸標準溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 ml分別于7支25 ml比色管中，依次加入80%甲醇溶液1.00、0.90、0.80、0.70、0.60、0.40、0.20 ml。測樣品時，吸取試液1.00 ml。然后加入1.00 ml Folin-Ciocalteu試劑，充分振蕩后，依次加入50 g/L Na2CO3溶液溶液8.00 ml，充分搖勻，45 min后，于25 ℃下，在765 nm處測其吸光度，以吸光度對沒食子酸標準溶液的質量濃度作圖，酚含量在1～40 mg/L范圍內與吸光度呈良好的線性關系，線性計算公式y=0.015 9x-0.002 5，r=0.999 5。

2.2 總酚量測定結果

按照“2.1”分析步驟，對葡萄皮試液1號、2號和家釀葡萄酒3號、4號、5號試液各進行6次平行測定，葡萄皮總酚含量計算公式：葡萄皮總酚含量（mg/g）=xVn/ms，其中x=（y+0.002 5）/0.015 9（mg/L），V=0.001 L，n=100（稀釋倍數），ms為葡萄皮試樣的質量;葡萄酒總酚含量計算公式：葡萄酒總酚含量（mg/L）=nx，x=（y+0.002 5）/0.015 9（mg/L），n=100（稀釋倍數）[7]。葡萄皮和家釀葡萄酒總酚含量測定結果見表1和表2。

由表1、2可見，平行測定樣品總酚含量的RSD在1.1%～1.6%，說明該方法具有較好的精密度。

表1 葡萄皮總酚量測定結果

表2 家釀葡萄酒總酚量測定結果

2.3 回收率試驗結果

利用“2.2”節的分析結果，分別按1號葡萄皮試液總酚含量的63.3%、94.9%、126.6%和3號家釀葡萄酒試液總酚含量的65.8%、98.7%、131.6%，添加50.0 mg/L沒食子酸標準溶液，各平行試驗3次，測定其總酚含量，并計算回收率。試驗結果見表3，可見該方法具有較好的回收效果。

表3 回收率試驗結果

3 結論與討論

以Folin-Ciocalteu 法測定昭通葡萄及其家釀葡萄酒的總酚含量。選用50.0 mg/L沒食子酸溶液為標準，其質量濃度在1～40 mg/L范圍內與吸光度呈良好的線性關系（y=0.015 9x-0.002 5，r=0.999 5）。準確稱取40 ℃下烘干葡萄皮0.050 g，采用80%甲醇溶液作為溶劑，在40 ℃、40 kHz超聲提取昭通葡萄皮總酚。移取1.00 ml試液，以1.00 ml Folin-Ciocalteu試劑和8.00 ml 50 g/L Na2CO3溶液處理，顯色45 min后，在765 nm處測定葡萄皮和家釀葡萄酒試液的吸光度。平行測定（n=6）總酚含量RSD在1.1%～1.6%。對葡萄皮和葡萄酒試液進行加標回收率試驗的平均回收率分別為98.8%、98.3%，RSD分別為1.8%、2.0%。該法操作簡便，具有較好的精密度，重復性好。

2種品種的市售昭通葡萄總酚含量有一定的差別，可能是因為購進的葡萄品種不一樣，再加上葡萄的種植方式和生長周期可能也不相同等因素所致。昭通葡萄總酚含量的高低具體受哪些因素影響及其如何影響的問題，還待進一步研究。3種家庭釀制的葡萄酒總酚含量差別較大，可能是因為各個家庭釀制葡萄酒時選用了不同品種的昭通葡萄、采用了

不同釀制工藝、在不同環境下以不同的方式保存葡萄酒和保存家釀葡萄酒的時間長短不一等因素所致[8]。

參考文獻

[1]李文仙，俞丹，林玲，等.Folin-Ciocalteu比色法應用于蔬菜和水果總多酚含量測定的研究[J].營養學報，2011，33（3）：302-307.

[2] 楊勇，楊俊祥，宮霞，等.葡萄及葡萄屬植物中的天然活性物質研究與利用現狀[J].釀酒科技，2011，204（6）：75-79.

[3] 左麗麗，王振宇，樊梓鸞，等.植物多酚類物質及其功能研究進展[J].中國林副特產，2012，120（5）：39-43.

[4] 李靜，聶繼云，王孝娣，等.Folin-Ciocalteus法測定葡萄和葡萄酒中的總多酚[J].中國南方果樹，2007，36（6）：86-87.

[5] 徐國前，張振文，郭安鵲，等.微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚[J].食品科學，2010，31（18）：268-270.

[6] 蔡文國，吳衛，邵金鳳，等.Folin-Ciocalteu法測定魚腥草多酚的含量[J].食品科學，2010，31（14）：201-204.

[7] 李春陽，許時嬰，王璋.從葡萄廢棄物中提取分離多酚類生物活性物質[J].食品科技，2004，152（6）： 88-93.

[8] 于貞，趙光鰲，李記明.葡萄皮中的酚類物質對葡萄酒中酚含量的影響[J].釀酒科技，2010，190（4）：46-47.