RNAi體外沉默淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞VEGFR—3基因表達(dá)

陳永春??金海峰??謝立平??王麗芳??張梅??李珅??高喜仁??李靜平

[摘要] 目的 應(yīng)用聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）包裹淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞（lymphatic endothelial progenitor cells，LEPCs）血管內(nèi)皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）基因siRNA，體外沉默VEGFR-3基因表達(dá)，研究抑制LEPCs分化抗腫瘤淋巴管新生的作用。 方法 Ficoll法分離人臍血單個核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀、免疫熒光分選并鑒定LEPCs。PEI包裹VEGFR-3siRNA并轉(zhuǎn)染入LEPCs，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR和Western blot檢測mRNA和蛋白質(zhì)水平VEGFR-3基因沉默效果。 結(jié)果 VEGFR-3siRNA成功轉(zhuǎn)入LEPCs，轉(zhuǎn)染效率30%。VEGFR-3siRNA轉(zhuǎn)染組LEPCs VEGFR-3mRNA和蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）。 結(jié)論 體外經(jīng)由PEI介導(dǎo)的siRNA能有效的抑制LEPCs VEGFR-3的表達(dá)，為以LEPCs為靶點抑制腫瘤淋巴管新生提供了實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞；VEGFR-3；聚乙烯亞胺；siRNA；淋巴管新生

[中圖分類號] R737.14 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）18-11-04

腫瘤淋巴管的新生與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系，能否有效抑制腫瘤淋巴管新生成為腫瘤治療的研究熱點。2005年，Wang等[1]繼Salven[2]之后提出了CD34+/CD133+/VEGFR-3+細(xì)胞為LEPCs。在趨化因子的作用下，LEPCs動員、遷移至病變組織，血管內(nèi)皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor，VEGF-C）通過VEGF-C/VEGFR-3信號途徑誘導(dǎo)其向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化，進(jìn)而促使新的淋

巴管生成[3-4]。Religa等[5]對淋巴管炎癥角膜小鼠進(jìn)行輻射處理后輸入骨髓源性的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)VEGFR-3+細(xì)胞出現(xiàn)在新生淋巴管中；Bogos等[6]檢測到小細(xì)胞肺癌患者血中CD34與VEGFR-3雙陽性細(xì)胞明顯增多，且與癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示，VEGFR-3在LEPCs參與的腫瘤淋巴管的新生中起重要作用[7]，如果我們靶向阻斷VEGFR-3來抑制VEGF-C/VEGFR-3信號途徑參與的腫瘤淋巴管新生，可達(dá)到抗腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的目的。

RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞，特異性地降解靶基因的mRNA，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的技術(shù)。本實驗應(yīng)用RNAi技術(shù)，擬將與VEGFR-3同源的siRNA轉(zhuǎn)染入LEPCs，抑制其分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，從而達(dá)到抗淋巴管新生的目的，為抗腫瘤淋巴管新生提供實驗依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM（Gibco），兔抗人VEGFR-3（Santa cruz），小鼠抗人CD133、CD34（Diagnostica），胎牛血清（四季青，杭州天杭生物科技有限公司），羊抗兔IgG FITC（Chemicon），羊抗小鼠IgG PE（Chemicon），羊抗兔IgG TRITC（Jackson），Trizol（Invitrogen），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），Ladder DNA、蛋白質(zhì)marker（Bio-rad），蛋白提取試劑盒（pierce），PEI（25kDa，Sigma Aldrich）。

流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，F(xiàn)ACSAria，BD）；PCR儀（9600型，PE）；轉(zhuǎn)膜儀和蛋白電泳儀（Bio-rad）；恒溫培養(yǎng)箱（Heraeu）；Olympus熒光顯微鏡、相差倒置顯微鏡（Nikon）。

1.2 單個核細(xì)胞的分離

取50～60mL足月正常分娩胎兒臍血，加入103 IU肝素。按Ficoll液密度梯度離心法[8]分離單個核細(xì)胞。將靜置后的上部血液等量稀釋后加于Ficoll液面上，F(xiàn)icoll液與稀釋血液的比例約為1∶2，離心（360g，25min）。將含有單個核細(xì)胞的液段移至另一離心管，PBS混懸后離心（250g，12min），收集細(xì)胞。

1.3 LEPCs的分選

用PBS（含1%BSA）清洗細(xì)胞，PBS混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1×107個/mL，加兔抗人VEGFR-3（1∶100），4℃孵育55min。用PBS洗3次，加1∶100 TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，4℃孵育30min。PBS清洗后，用DMEM（含2.5%FBS）重懸細(xì)胞[9]，F(xiàn)ACS Aria流式細(xì)胞儀分選VEGFR-3陽性細(xì)胞。將分選出的細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行免疫熒光鑒定CD34和CD133的表達(dá)[4]。

1.4 VEGFR-3 siRNA抑制率的檢測

1.4.1 VEGFR-3 siRNA的設(shè)計（表1）與合成（上海生工）

1.4.2 體外轉(zhuǎn)染 （1）siRNA/PEI溶液的制備：將制得的PEI載體溶液（1mg/mL）滴加入siRNA溶液（1μg）中（N/P=8），振蕩，室溫孵育30min。（2）每

孔4×104個細(xì)胞接種于24孔板至細(xì)胞匯合度40%～60%，PBS清洗，加入無血清的DMEM。（3）將siRNA/PEI溶液分別加入細(xì)胞中輕輕混勻，轉(zhuǎn)染6h后，更換完全培養(yǎng)基。熒光顯微鏡觀察后消化細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率。

1.4.3 半定量RT-PCR 實驗分五組：空白轉(zhuǎn)染組、對照轉(zhuǎn)染組、siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組。體外轉(zhuǎn)染同上，各組細(xì)胞數(shù)1×107，更換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至48h[10]。將Trizol 1mL加入培養(yǎng)皿中，吹打數(shù)次，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)至1.5mL EP管中，室溫靜置5min；加入氯仿0.2mL，振蕩15s，室溫放置10min，12 000rpm，4℃離心10min；將上層液體移至另一個1.5mL EP管中，加異丙醇0.5mL，冰上放置10min，12 000rpm，4℃離心10min；棄上清加75%乙醇1mL渦旋振蕩，8000rpm，4℃離心5min。棄去上清，干燥沉淀，加入40μL DEPC水溶解RNA。RT的反應(yīng)條件：30℃10min，45℃ 30min，99℃ 5min，4℃ 5min；PCR反應(yīng)條件：94℃ 2min，然后94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min，30個循環(huán)。VEGFR-3引物序列（f）5'TTTGTGGAGGGAAAGAATAAGA3'（r）5'GGACAGGTTGAGGGGCTA3'由上海生工合成，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。每組分別取3個樣本，實驗重復(fù)3次。endprint

1.4.4 Western blot 轉(zhuǎn)染步驟同上，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72h，棄培養(yǎng)基，用0.01M PBS浸洗2次。加入RIPA蛋白提取試劑，冰上裂解25min；用刮勺將細(xì)胞刮取至1.5mL EP管中（冰上操作），12 000rpm，4℃離心12min，上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，BCA法測蛋白含量。各組上樣量相同，SDS-PAGE電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白用濕式電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含3%BSA封閉液封閉，然后1mL兔抗人VEGFR-3抗體稀釋液（1∶200）處理，以同樣的方式加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育2h。用ECL法顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，用（）表示；多組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外轉(zhuǎn)染結(jié)果

N/P=8時，流式細(xì)胞儀檢測siRNA/PEI轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率為30%。

2.2 各組VEGFR-3 siRNA抑制VEGFR-3表達(dá)的分析

2.2.1 半定量RT-PCR結(jié)果分析 各組VEGFR-3mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，空白與陰性轉(zhuǎn)染組之間無差異，siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較均有顯著差異，其中siRNA a組抑制效率最高（圖1）。

Marker 空白 陰性 a b c

GAPDH（590bp）

VEGFR-3（261bp）

A

B

A：VEGFR-3siRNA/PEI轉(zhuǎn)染LEPCs48h各組VEGFR-3mRNA的表達(dá)。B：統(tǒng)計學(xué)結(jié)果siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05，*P<0.01，siRNAa組與siRNAb組、siRNAc組比有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05

圖1 半定量RTPCR結(jié)果分析

2.2.2 Western blot檢測結(jié)果分析 轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞VEGFR-3蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，空白與陰性轉(zhuǎn)染組之間無差異siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較均有顯著差異，其中siRNA a組抑制效率最高（圖2）。此結(jié)果在蛋白水平上符合半定量RT-PCR的實驗結(jié)果。

空白 陰性 a b c

VEGFR-3165KD

β-actin 43KD

C

D

C：VEGFR-3siRNA/PEI轉(zhuǎn)染LEPCs72h各組VEGFR-3蛋白的表達(dá)。D：統(tǒng)計學(xué)結(jié)果siRNA a組、siRNA b組、siRNA c組與空白轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05，*P<0.01，siRNAa組與siRNAb組、siRNAc組比有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05

圖2 Westem blot 檢測結(jié)果

3 討論

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞可經(jīng)新生的淋巴管轉(zhuǎn)移[11]，抑制腫瘤淋巴管新生對腫瘤治療至關(guān)重要。LEPCs參與腫瘤淋巴管新生已成為研究熱點[12]。LEPCs可遷移和定居到腫瘤，參與腫瘤淋巴管新生[3，13-14]。關(guān)于LEPCs參與淋巴管新生的機(jī)制尚未完全明確。本實驗在體外將VEGFR-3siRNA轉(zhuǎn)染入LEPCs。裸siRNA分子易降解且靶向性差，目前多采用借助載體給藥，陽離子聚合物具有較低的免疫原性和細(xì)胞毒性多被應(yīng)用于研究[15]。PEI是一種被廣泛用于DNA和siRNA等的陽離子聚合物載體，通過形成納米粒包裹siRNA后給藥[16]。

本研究采用分子量為25KDa的PEI為載體介導(dǎo)VEGFR-3siRNA的轉(zhuǎn)染，成功轉(zhuǎn)染VEGFR-3siRNA進(jìn)入LEPCs內(nèi)，用RT-PCR和Western blot檢測mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，證實了VEGFR-3siRNA對靶基因VEGFR-3的沉默效果。說明通過利用RNAi技術(shù)能夠在體外靶向抑制LEPCs VEGFR-3的表達(dá)，進(jìn)而干擾VEGF-C/VEGFR-3信號途徑，抑制其分化和淋巴管新生。如果以體外實驗結(jié)果作為基礎(chǔ)，將VEGFR-3siRNA導(dǎo)入LEPCs并靶向于腫瘤，可能會抑制淋巴管新生引起的腫瘤轉(zhuǎn)移。

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