烏司他丁對(duì)大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制

王媛媛 曹 建 鄧 莉 陳 勤 歐陽(yáng)先國(guó)

1.南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330009；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，江西南昌 330006

烏司他丁是一種廣譜的蛋白水解酶抑制劑，可以抑制體內(nèi)多種蛋白水解酶的活性，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的釋放，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[1]。研究表明氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞和細(xì)胞凋亡等因素均可能參與心肌缺血再灌注損傷心肌的發(fā)病過(guò)程[2-3]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了烏司他丁對(duì)缺血再灌注細(xì)胞的心肌組織梗死范圍及白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-8的表達(dá)，探討烏司他丁對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

取10周左右雄性SD大鼠30只，體重（200±20）g（南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），烏司他丁注射液，100 000 U/瓶（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)03080806），超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（武漢亞法生物制品有限公司生產(chǎn)），anti-IL-6、anti-IL-8、小鼠單抗辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG、anti-β-actin 山羊單抗（SantaCruz產(chǎn)品）。

1.2 分組及模型制作

30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，分為假手術(shù)組、缺血再灌注（I/R）組、I/R+烏司他丁組，每組各10只。假手術(shù)組，絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左室支但不結(jié)扎，經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。I/R組參考趙秀梅等[4]的墊扎球囊法制作大鼠模型。將充盈的球囊（215 mm×10 mm）墊于冠狀動(dòng)脈前降支與結(jié)扎線之間，用力結(jié)扎，觀察結(jié)扎區(qū)域變白，局部心肌運(yùn)動(dòng)減弱，兩個(gè)以上導(dǎo)聯(lián)上出現(xiàn)ST段明顯上抬，提示結(jié)扎成功。45 min后將球囊快速抽空便可即刻實(shí)現(xiàn)前降支血流再灌注（以心電圖相關(guān)導(dǎo)聯(lián)ST段明顯回落為標(biāo)準(zhǔn)），并持續(xù)再灌注3 h。I/R組，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后5 min分別通過(guò)尾靜脈接受靜脈注射注射生理鹽水，45 min后放松扎線使冠狀動(dòng)脈再通形成再灌注3 h至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；I/R+烏司他丁組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈左室支前30 min靜脈注射烏司他丁（50 000 U/kg），其余同 I/R 組。

1.3 生化指標(biāo)檢測(cè)

缺血再灌注120 min后自腹主動(dòng)脈取血6 mL，靜置30 min，4℃3000 r/min離心10 min，離心半徑為5 cm，分離血清。按照試劑盒說(shuō)明采用化學(xué)比色法測(cè)定血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）和MDA、谷胱甘肽（GSH）含量。

1.4 心肌缺血和梗死范圍測(cè)定

通過(guò) 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色將心肌切片梗死區(qū)染成灰白色，缺血區(qū)染成磚紅色，非缺血區(qū)染成藍(lán)色，掃描后采用圖像分析軟件分別計(jì)算各部分的面積。缺血的范圍用缺血心肌面積與左心室面積之比表示，而梗死范圍以梗死心肌面積與缺血心肌面積之比表示。

1.5 Western blot法檢測(cè)IL-6、IL-8蛋白水平

分別取適量三組大鼠心肌組織，提取總蛋白，收集上清液，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行擔(dān)保定量。SDS-PAGE分離樣品后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，洗滌緩沖液（TBST）常溫下封閉過(guò)夜后，分別加入小鼠單抗（一抗）、室溫下免疫沉淀1 h，加入辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，顯色。用 Gel-ProAnalyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA、CK-MB水平比較

與假手術(shù)組比較，I/R組MDA、CK-MB含量明顯增加，GSH含量減少，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與I/R組比較，I/R+烏司他丁組MDA、CK-MB含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），GSH含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組肌酸激酶同工酶、丙二醛、谷胱甘肽水平比較（±s）

表1 三組肌酸激酶同工酶、丙二醛、谷胱甘肽水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P ＜ 0.01；與 I/R 組較，#P ＜ 0.05；I/R：缺血/再灌注；CK-MB：肌酸激酶同工酶；MDA：丙二醛；GSH：谷胱甘肽

組別 只數(shù) CK-MB（U/L）MDA（nmol/L）GSH（mg/L）假手術(shù)組I/R組I/R+烏司他丁組10 10 10 15.21±6.24 2752.21±1276.36*1873.24±621.43#4.13±3.27 11.13±2.13*8.25±4.26#241.42±3.28 184.26±2.14*202.27±4.38#

2.2 心肌缺血范圍和梗死面積

假手術(shù)組未見(jiàn)心肌缺血及梗死，I/R組、I/R+烏司他丁組心肌缺血范圍分別為（49.72±5.36）%、（51.12±6.24）%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。I/R組梗死面積為（17.12±3.18）%，I/R+烏司他丁組梗死面積為（12.27±4.26）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

2.3 心肌組織IL-6、IL-8蛋白表達(dá)情況

通過(guò) Western blot法檢測(cè)各組 IL-6、IL-8蛋白水平，假手術(shù)組IL-6、IL-8含量較低，缺血再灌注后，I/R組IL-6、IL-8表達(dá)升高，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示缺血再灌注可以誘導(dǎo)炎性因子IL-6、IL-8釋放；與I/R組比較，I/R+烏司他丁組炎性因子IL-6、IL-8含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示烏司他丁可以減少炎癥因子表達(dá)。見(jiàn)表2。

表2 三組IL-6、IL-8蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 三組IL-6、IL-8蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與 I/R 組比較，#P<0.05；I/R：缺血/再灌注；IL：白細(xì)胞介素

組別 只數(shù) IL-6 IL-8假手術(shù)組I/R組I/R+烏司他丁組10 10 10 0.412±0.550 1.785±0.720*1.102±0.780#0.132±0.071 0.926±0.247*0.672±0.240#

3 討論

烏司他丁能夠廣譜高效抑制多種炎癥因子的釋放，是從健康人尿中提取精制的糖蛋白。研究表明烏司他丁對(duì)于消除自由基降低炎性介質(zhì)水平有明顯的作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)，I/R組MDA、CK-MB含量明顯增加，GSH含量減少，I/R+烏司他丁組MDA、CK-MB含量明顯減少，GSH含量增加，提示烏司他丁可能通過(guò)增加GSH含量，清除過(guò)氧化物代謝，從而減少細(xì)胞氧化損傷，對(duì)缺血再灌注心肌損傷具有保護(hù)作用。

心肌缺血再灌注損傷中，氧自由基的釋放及抗氧化酶活性降低，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損[7]。同時(shí)炎癥因子也占有重要地位，心肌早期缺血、缺氧所造成的炎性反應(yīng)又可促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞大量釋放白細(xì)胞介素，后者作為一種強(qiáng)特異性的中性粒細(xì)胞趨化因子，進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞的聚集，并促使中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性產(chǎn)物，加重炎性反應(yīng)，損害心肌細(xì)胞[8-10]。炎癥因子水平的高低和缺血后心臟功能的損害及細(xì)胞壞死數(shù)量的多少直接相關(guān)，說(shuō)明炎性反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中起了非常重要的作用。

IL-8主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，其他如血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等也能產(chǎn)生IL-8。目前，對(duì)于IL-8參與心肌缺血再灌注損傷的研究頗多，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌缺血和缺血再灌注后血中IL-8平均明顯升高。IL-6一直以來(lái)被認(rèn)為是參與急性期反應(yīng)的Th2類細(xì)胞因子，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌組織IL-6含量在缺血再灌注后有顯著性增加[11-14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)烏司他丁處理后IL-6、IL-8蛋白表達(dá)，與假手術(shù)組比較，I/R組IL-6，IL-8升高；與I/R組比較，烏司他丁組IL-6，IL-8表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且CK-MB及心肌梗死面積下降，提示烏司他丁可以通過(guò)抑制炎性反應(yīng)，降低炎癥因子表達(dá)，減少心肌細(xì)胞氧化損傷的途徑，減輕心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制有待于進(jìn)一步臨床試驗(yàn)論證。

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