水樣發光細菌急性毒性測試的方式與表征

孫成華，劉 康，衡麗娜，劉保獻

北京環境保護監測中心，北京 100048

對排放物毒性的評價和控制的經典方法是對特定化學物質的指標監測和限制，如工業廢水的評價和控制主要圍繞綜合指標(BOD5、COD、DOC、TN、TP等)和單一的有毒有害指標(如典型重金屬、有毒有害的特定有機物)開展，但是這些指標的監測和評價均存在一定的局限性［1］。一方面，實際的環境樣品中可能存在很多未知的化合物，對于綜合性樣品的研究表明，特異性化學分析測定未知樣品的毒性僅占毒性檢測的20%;另一方面，毒性效應是所有組成物質協同或拮抗作用的綜合結果，李專等［13］對工業廢水的研究表明，部分企業排放的化學指標合格的廢水對生物還具有不同程度的毒性，所以單純化學物質的監測和限定不能為水體的安全提供充分的保障。生物毒性試驗應用“黑箱”方法，它不是揭示水中含有哪些污染物以及確定污染物濃度，而是綜合反映廢水對生物毒性的大小及危害程度。目前，許多國家已應用生物學方法對排放物毒性進行測定和評價，從而最終判定環境樣品的綜合毒性效應。對環境樣品進行生物毒性測試是化學分析的必要補充和延伸。

發光細菌毒性檢測技術基于在一定實驗條件下發光細菌發光強度恒定，任何毒性物質抑制其正常代謝，都會導致發光強度的減弱，毒性越強，對代謝的抑制作用越強，發光被抑制得越厲害的原理。該技術是目前國際上研究最多的毒性檢測技術，有國際、國內標準支持［5-11］。

美國、加拿大、德國等發達國家早在20世紀七八十年代就已經開始實施廢水綜合毒性控制，并制定了相應的毒性控制標準［1］。德國水管理法(WHG)明確規定了廢水排放的發光細菌毒性限制值，填埋場滲出液、工業冷卻水、化學工業的廢水的稀釋因子(GL) 分別為 4、12、32［1］。2008年起，中國對發酵類制藥行業也開始實施發光細菌毒性控制管理，標準限值采用等效氯化汞的質量濃度［1］。為了解不同類型的環境樣品對發光細菌的毒性狀況，應用費氏弧菌(Vibrio fischeri)，依據 ISO 11348-3［10］費氏弧菌凍干法，從環境質量樣品及污染源樣品中選取不同類型的水樣，開展了發光細菌毒性測試，探討了不同環境管理目標的樣品急性毒性定量表征方式。

1 實驗部分

1.1 材料

MicroTox稀釋液，MicroTox滲透壓調節液，MicroTox補充液，實驗用小玻璃試管，費氏弧菌凍干粉(批號 12B4022、12K4130A);10 ～100 μL 可調節取樣槍，100～1 000 μL可調節取樣槍;苯酚標準溶液(標準號 GSB 07—1281-2000，批號102309)，七水硫酸鋅(分析純);Microtox Model 500毒性檢測系統，儀器配備了30孔溫控培養室，溫度控制在(15±0.5)℃;恒溫調節溫控菌種培養槽，溫度控制在(5.5±1)℃;實驗樣品測試井，溫度控制在(15±1.0)℃。旋渦混合器、定時器。

污水處理廠進出水、垃圾填埋場周邊地下觀測井井水、部分工業企業生產廢水、地下生活飲用水及地表水源樣品。

1.2 方法

1.2.1 發光細菌復蘇前準備

將凍干細菌容器小瓶從－20℃的冷凍柜中取出，輕輕叩擊瓶壁使凍干菌落入瓶底，回升溫度到4℃左右。在恒溫調節溫控(5.5±1)℃菌種培養槽的孔中放置一個測試試管，如復蘇小支菌粉，在管中加入1 mL MicroTox稀釋液，如復蘇大支菌粉，在管中加入1 mL MicroTox補充液，使其恒溫保持在(5.5±1)℃。

1.2.2 樣品測試準備

根據待測樣品數量準備實驗試管，插入溫控培養室試管井中，A、C、E排試管用于待測樣品，A1加入1 mL MicroTox稀釋液作為對照，A2～A5、C1～C5、E1～E5管中加入1 mL待測樣品和0.1 mL MicroTox滲透壓調節液，混勻保持在(15±1)℃。

B、D、F排實驗前每支試管內加入0.1 mL復蘇好的發光菌懸浮液。

1.2.3 凍干菌粉復蘇

在回升溫度到4℃左右的菌粉瓶中加入(5.5±1)℃的稀釋液或補充液，小包裝菌粉每支加入0.3～0.4 mL稀釋液，用旋渦混合器振蕩混勻，置于(15±1)℃試管井復蘇15 min開始實驗，大包裝菌粉每支加入1 mL MicroTox補充液混勻制成發光細菌濃縮液，使其恒溫保持在(5.5±1)℃復蘇5 min，實驗時取濃縮菌液，按1∶10比例用MicroTox稀釋液稀釋置于(15±1)℃試管井復蘇15 min開始實驗。

1.2.4 樣品測試

Model 500毒性檢測系統設置了不同的操作程序，按照儀器操作程序指示在發光菌復蘇15 min后開始實驗，先測試0.1 mL發光菌初始發光值，再往每支菌液試管加入0.9 mL已恒溫在(15±1)℃的稀釋液或調整好滲透壓的樣品溶液，混勻，計時，然后測試發光強度的變化。樣品毒性初步篩選實驗按照81.9%Screening Test模式，每個樣品測試平行雙樣，每批次樣品加空白或毒性參照物做質控樣，初篩實驗時發光抑制率在60%以上的高毒樣品，將樣品按指數梯度稀釋，按照81.9%Basic Test模式進行半數效應濃度(EC50)試驗。2個模式均可同時測試樣品與菌種接觸5 min及15 min的發光抑制情況。

2 結果與討論

2.1 毒性測試質量控制

2.1.1 標準曲線

依據美國的標準方法要求，選擇了易溶、穩定、常見、價廉、對人和環境危害小的苯酚和硫酸鋅為毒性參照物，將苯酚、七水硫酸鋅標準溶液按指數梯度稀釋，按照81.9%Basic Test模式進行實驗，對測試數據進行回歸分析，建立苯酚濃度或硫酸鋅濃度與發光抑制率的回歸方程，求出苯酚或硫酸鋅的EC50，苯酚和硫酸鋅的EC50基本符合美國標準方法［11］規定:苯酚為 13～26 mg/L，硫酸鋅為5～12 mg/L。苯酚曲線的相關系數(R2)為0.983 2～0.991 5，硫酸鋅標準溶液曲線的相關系數(R2)為0.888 9～0.956 0。圖1、圖2分別為苯酚、硫酸鋅的回歸曲線。

圖1 苯酚濃度與發光抑制率的擬合曲線

圖2 七水硫酸鋅濃度與發光抑制率的擬合曲線

2.1.2 方法的精密度

控制相同濃度的毒性參照物的相對標準偏差在10%以內。對同一低濃度硫酸鋅溶液，5 min發光抑制率平均值與15 min發光抑制率平均值差異較大，在測試水樣綜合毒性尤其是可能由于重金屬污染引起的毒性時，應選擇15 min或更長的暴露時間。實際水樣的急性毒性測試結果均按照樣品與菌種接觸15 min的測試結果進行統計計算。

2.1.3 空白值的質量控制

為保證測試結果有效，排除因菌液質量不穩定帶來的誤差，每批次樣品測試時要加1～2個MicroTox稀釋液作空白樣或加一個毒性參照物作質控樣。空白值波動曲線見圖3，控制實驗的空白發光抑制率在－10% ～10%之間［3］。

圖3 空白樣的發光抑制率波動曲線

2.2 在飲用水源監測中的應用

發光細菌急性毒性測試在飲用水源監測的應用目標是對突發污染事故進行預警，一般情況下以發光抑制率低于20%作為毒性污染的判定值，但自然水體成分復雜，可能存在適于微生物生長的元素，會出現刺激發光細菌發光的情況。在飲用水源監測中，利用大量日常測試的無毒樣品的發光抑制率值為背景值，按照公式 D=μ±3SD(式中μ為監測數據的平均值，SD為標準偏差)的統計方法［4］，計算出各水源水、地下水的毒性預警基準線，能更及時準確地判斷飲用水源是否受到毒性污染。圖4為應用某地表水源日常監測數據繪制的毒性預警基線圖，樣品發光抑制率落在－24.3% ～16.5%之間為正常;圖5為應用33口井水的測試值繪制的毒性預警基線圖，對于地下水樣品，發光抑制率落在－33.1% ～－1.9%之間為正常。日常監測的無毒性基礎數據可以隨時補充代入計算，數據越多，生物毒性預警的準確率越高。

圖4 某地表飲用水源發光細菌急性毒性測試預警區間

圖5 地下飲用水發光細菌急性毒性測試預警區間

2.3 在污染源監督監測中的應用

應用發光細菌測試了6家垃圾填埋場周邊34口觀測井井水的急性毒性，按照發光抑制率大于20%的毒性經驗判定值來統計，有2個發光抑制率大于50%的高毒樣品，有1個發光抑制率接近20%的低毒樣品，結果見圖6。但按照地下水的預警區間統計(圖5)，發光抑制率低于20%的樣品中有11個樣本有輕微毒性。同時測試了6個處理后的垃圾滲瀝液樣本，發光抑制率均為負值，對發光細菌未產生急性毒性。測試了一個未經處理的垃圾滲瀝液樣本，發光抑制率為96.3%，毒性極強。

圖6 2013年垃圾填埋場周邊觀測井井水發光細菌毒性測試結果

應用發光細菌測試了34家城市污水處理廠的處理后出水，除了1家發光抑制率為4%，其余33家均為負值;測試了5家企業處理設施出水樣本17個，其中12個樣本發光抑制率均為負值，表明經過生化處理的出水對微生物的急性毒性風險很低。現代廢水處理工藝中都要利用馴化的微生物群落降解有機物，因此生化處理后的出水如未經加氯消毒處理，對處于同一營養層的發光細菌的發光不會產生影響。廢水經凈化處理，達到一定的排放標準后，仍可能含有痕量有毒有害污染物［3］，這些物質是否存在慢性毒性以及是否對其他種類生物產生毒害作用還需要進一步的實驗證明，因此應選用營養級別更高的生物對生化處理后的出水開展毒性測試，以降低排水對受納水體生物的影響，從而保證水環境的生態安全。

對21個不同類型的污染源水樣進行了發光細菌毒性測試，分別為7個污水處理廠進水、1個機電企業生產廢水、1個防水技術企業廢水、1個化工生產廢水、9個重金屬相關企業廢水、2個未處理的垃圾填埋場滲瀝液。其中，12個樣品發光抑制率大于20%，有57.1%的樣品顯示出對發光細菌的毒性效應，這期間9個樣品發光抑制率在50%以上，毒性很強(圖7)。對于這些毒性較強的樣品需要進行進一步的試驗確定其毒性大小。發光抑制率在60%以上的高毒樣品，將樣品按指數梯度稀釋，按照 81.9%Basic Test模式進行EC50試驗;發光抑制率在60%以下的樣品將發光抑制率值代入苯酚或硫酸鋅標準曲線公式，計算相當于毒性參照物的當量濃度。

圖7 不同類型污染源水樣發光細菌毒性測試結果

2008年起，中國對發酵類制藥行業開始實施發光細菌毒性控制管理，標準限值采用氯化汞的質量濃度，排放限值為氯化汞的質量濃度(0.07 mg/L)［1］。選擇1家制藥企業的廢水進行了發光細菌毒性測試，結果見表1。王麗莎等［2］曾經應用明亮發光桿菌比較過鋅離子和氯化汞的毒性，并計算出兩者之間毒性強度的關系，氯化汞的毒性是鋅離子毒性的12.5倍。按照這個系數可以計算3個出水的氯化汞質量濃度分別為0.86、0.03、0.02 mg/L。由于這個系數是應用明亮發光桿菌測試得到的，這樣的計算可能不一定適用于費氏弧菌實驗，卻有所啟示:應用費氏弧菌測試氯化汞、七水硫酸鋅毒性，建立起兩者毒性強度之間的相關關系，就可以使用低毒的硫酸鋅為參照物測試制藥廢水，同時避免劇毒的氯化汞危害人體健康和生態環境。

表1 制藥企業出水的發光細菌毒性測試結果

2.4 發光細菌毒性定量表征

對于發光細菌急性毒性的定量表征方式，中國國標測試方法選用的是等效氯化汞或苯酚的質量濃度，國內也有科研人員采用百分數等級劃分標準［12］衡量樣品毒性。德國在生物毒性監測管理中，應用GL定量表征生物毒性。在發光細菌毒性測試中，將樣品稀釋成系列濃度并測定每個稀釋濃度的發光抑制率，其中造成20%或20%以下發光抑制率的樣品的稀釋倍數即為GL，稀釋因子直觀反映了廢水稀釋到什么程度再排放才對水環境生物無不良影響。美國、加拿大、愛爾蘭采用EC50來定量表征發光細菌毒性［1］，EC50能清楚地區分不同樣品的毒性大小，但在水樣毒性小于半數效應的濃度時難以確定毒性的效應水平。表2列出了不同樣品應用這些不同的毒性表征方式計算所得的結果。

表2 樣品發光細菌毒性不同的定量表征結果

從表2和圖1可以看出，當樣品發光抑制率小于60%時，用參比物(苯酚)質量濃度表示毒性直觀清楚;當樣品發光抑制率大于60%時，表示等效毒性參比物(苯酚)的曲線趨于平直，說明即使不斷增加苯酚濃度，發光抑制率的變化也不再顯著。這表明，按標準曲線計算出的苯酚質量濃度已不能準確表征各樣品之間毒性的實際差異。

當樣品發光抑制率大于60%時，將樣品按指數梯度稀釋，測試各稀釋度樣品的發光抑制率，繪制樣品稀釋度與發光抑制率的擬合曲線，依據曲線計算EC50或稀釋因子，稀釋因子直觀反映了廢水毒性消失的稀釋倍數，因此，稀釋因子定量表示高毒樣品的毒性，直觀地反映了環境樣品對生物的影響，體現出在工業廢水毒性管理中良好的應用價值。

3 結論

發光細菌急性毒性測試在環境應急監測、水源早期生物預警中，采用繪制毒性預警基線圖的方式比較可行;在污染源監督監測中，對于發光抑制率低于60%、無法求出EC50的樣品，采用等效毒性參照物的質量濃度表征廢水的毒性，對于發光抑制率高于60%時，采用稀釋因子表示樣品的毒性更直觀可靠。

城市污水處理廠的出水、經過生化處理后工業廢水、滲瀝液等，雖然均刺激發光細菌發光強度增加，但僅僅代表生化處理出水對發光細菌沒有急性毒性。廢水經凈化處理后，達到一定的排放標準，仍可能含有痕量有毒有害污染物，這些物質是否存在慢性毒性以及是否對其他種類生物產生毒害作用還需要進一步的實驗證明。

應用發光細菌測試垃圾填埋場觀測井、滲瀝液、工業企業生產廢水、污水處理廠進水等樣品毒性，可以避免或減少廢水過高的毒性對污水處理工程菌的危害，降低處理成本。應加強對這些樣品生物毒性的監督監測，建立起相應的毒性監督管理標準，從而有效地督促工業企業對廢水處理工藝的改進和優化，保證工業廢水安全排放，控制水環境污染，保護水資源。

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