基于8-氨基1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽的糖基化蛋白質標記方法

秦新英，李瑞

（1.河北大學 化學與環(huán)境科學學院，河北省化學生物學重點實驗室，河北保定 071002；

2.固廢資源化利用與節(jié)能建材國家重點實驗室，北京 100041）

基于8-氨基1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽的糖基化蛋白質標記方法

秦新英1，李瑞2

（1.河北大學 化學與環(huán)境科學學院，河北省化學生物學重點實驗室，河北保定 071002；

2.固廢資源化利用與節(jié)能建材國家重點實驗室，北京 100041）

發(fā)展了基于熒光試劑8-氨基1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽（ANTS）的糖基化蛋白質選擇性標記和熒光檢測的新方法.實驗中以標準蛋白質細胞色素c和核糖核酸酶b為樣品，優(yōu)化了pH和反應時間.在優(yōu)化的條件下，核糖核酸酶b的檢測靈敏度可提高22倍，而非特異性的標記僅為1%，顯示了這種衍生方法極好的選擇性.進一步將該方法應用于卵清蛋白的衍生，通過結合二氧化鈦（TiO2）親和富集，共鑒定到14個蛋白質，其中超過85%的蛋白質具有一致的N-X-T／S（X為除脯氨酸以外的其他氨基酸）序列，為潛在的糖基化蛋白，進一步驗證了該方法的高選擇性.

8-氨基1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽；糖基化蛋白質；標記；熒光檢測

糖基化蛋白質是一種重要的翻譯后修飾蛋白質，在生命體中發(fā)揮著重要的作用.糖基化蛋白質結構的變化與多種癌癥的發(fā)生息息相關，使得許多種糖基化蛋白質成為癌癥診斷和治療的重要靶點［1－3］.因此，實現有效和靈敏的糖基化蛋白質檢測具有重要的意義.

熒光檢測是目前最為靈敏的檢測方式之一，廣泛應用于生命科學中的諸多領域，實現了改進的生物分子檢測效率［4］.例如，Qiao［5］等將水溶性的磺酸-3-氫-吲哚菁染料sb-cy3-NHS應用于蛋白質的衍生和熒光檢測，牛血清白蛋白的檢測限可降低到12.8nmol／L，與采用常用的熒光試劑苯異硫氰酸酯衍生后的檢測限相比可降低約100倍，顯著地提高了蛋白質的檢測靈敏度.在糖基化蛋白質研究中，熒光衍生技術多用于糖基化蛋白中釋放的寡糖的衍生和檢測［6］，而糖基化蛋白質的選擇性衍生和檢測的技術尚未見報道.

8-氨基-1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽（ANTS）是經典的多糖熒光標記試劑［7］，本文初步嘗試將ANTS應用于糖基化蛋白質的衍生，通過優(yōu)化反應條件，實現了復雜樣品中糖基化蛋白質的選擇性衍生和靈敏的熒光檢測.該方法有望為后續(xù)深入的糖基化蛋白質研究提供新途徑.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

ANTS、細胞色素c、核糖核酸酶b、伴清蛋白均購自于Sigma（St.Louis，MO，USA）.TiO2購自GL（Tokyo，Japan）.三氟乙酸（TFA）和氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）均購于Acros Organics（Geel，Belgium）.高碘酸鈉購自國藥集團.色譜純乙腈（ACN）購自Merck（Darmstadt，Germany）.所有無機試劑均為分析純，而其他試劑均為色譜純.實驗中用水采用Milli-Q系統(tǒng)（Millipore，Bedford，USA）純化制得.

1.2 蛋白質衍生

代表性的蛋白質衍生過程如圖1所示.具體如下，取10μL 50mg／mL卵清蛋白（溶解于100mmol／L乙酸-乙酸鈉，150mmol／L氯化鈉，pH 5.0），加入5μL 40mol／L高碘酸鈉（溶解于100mol／L乙酸-乙酸鈉，150mmol／L氯化鈉，pH 5.0），于25℃避光振蕩反應30min，然后加入10μL 80mmol／L亞硫酸鈉（溶解于100mmol／L乙酸-乙酸鈉，150mmol／L氯化鈉，pH 5.0），繼續(xù)于25℃反應10min，從而消除過量的高碘酸鈉.再加入50μL 0.5mg／50μL ANTS（溶解于100mmol／L 乙酸-乙酸鈉，pH 6.0），混勻后加入10μL新鮮配制的1.0mol／L NaCNBH3（溶解于二甲亞砜），25℃反應2h，從而實現糖基化蛋白質的標記.反應完畢，待進樣分析.

1.3 HPLC分析

HPLC測定在包含進樣閥（Rheodyne，Cotati，CA，USA）、配備四元梯度單元的智能色譜泵（Jasco，Tokyo，Japan）、智能熒光檢測器（Jasco，Tokyo，Japan）和紫外檢測器（大連依利特分析儀器有限公司）組成的色譜系統(tǒng)中進行，色譜柱為C8柱（250×4.6mm，5μm，30nm）.流動相A為純水（含體積分數0.1% TFA），流動相B為95%的ACN（含0.1%TFA）.熒光檢測激發(fā)和發(fā)射波長分別為360nm和515nm，紫外檢測波長為214nm.單個蛋白質分析梯度如下：0～30min，10%～70%B；流速：1mL／min.蛋白質混合物分離梯度：0～35min，10%～80%B；35～40min，80%～80%B；流速：1mL／min.卵清蛋白質分離梯度：0～60min，10%～80%B；60～80min，80%～80%B；流速，0.5mL／min.

圖1 糖基化蛋白質衍生示意Fig.1 Schematic diagram of glycoprotein derivatization

2 結果與討論

2.1 pH對衍生反應的影響

實驗中選擇了2個代表性的蛋白：核糖核酸酶b和細胞色素c.核糖核酸酶b是典型的糖蛋白，而細胞色素c是典型的非糖蛋白.實驗中以二者質量濃度比為1∶1的蛋白混合物考察了反應pH對衍生化的影響.共考察了7個pH，分別是4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0的緩沖體系.圖2為核糖核酸酶b的相對峰面積以及細胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比隨衍生反應pH變化趨勢圖，當衍生體系的pH為6.0時，細胞色素c與核糖核酸酶b的面積比值為最小，說明此時副反應系數最小，二者的比值為0.114，可以更好地實現對糖蛋白的衍生；從圖2中還可以看出，體系的pH越小，糖蛋白的衍生效果越好，但是pH太低時，會影響蛋白質的溶解性，因此最終選擇pH為6.0.

圖2 pH對核糖核酸酶b和細胞色素c的衍生效果的影響Fig.2 Effect of pH of buffer on the derivatization of ribonuclease b and cytochrome c

2.2 反應時間對衍生反應的影響

進一步考察了衍生反應時間對衍生效果的影響，核糖核酸酶b的相對峰面積以及細胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比隨衍生反應時間的變化趨勢如圖3所示.隨著反應時間的增加，核糖核酸酶b的峰面積逐漸增加，當反應時間超過2h后，峰面積趨于穩(wěn)定；細胞色素c和核糖核酸酶b峰面積比在反應時間1min時最大，以后顯著降低，并隨著衍生反應時間的增加副反應逐漸增加.當反應時間為2h時，核糖核酸酶b的峰面積達到最大峰面積的96%，并且在此時細胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比值較小且趨于穩(wěn)定，僅為3.6%，因此反應時間最終選擇為2h.

2.3 單個糖蛋白質衍生

在優(yōu)化的衍生條件下，以典型的糖蛋白核糖核酸酶b為模式蛋白，考察了熒光試劑ANTS的衍生效果.由于熒光試劑ANTS只與糖蛋白糖鏈氧化后形成的醛基反應，因此在衍生過程中若去掉氧化步驟，便可檢測吸附等非特異性標記.因此實驗中比較了0.22mg／mL核糖核酸酶b進樣10μL在3種情況下的色譜分離結果：第一，糖鏈氧化，熒光試劑ANTS標記，熒光檢測，如圖4a；第二，糖鏈不氧化，加入ANTS做空白實驗，熒光檢測，如圖4b；第三，直接進樣分析，紫外檢測，如圖4c.由圖可知，對于單個核糖核酸酶b來說，通過選擇性糖鏈標記，其檢測靈敏度與紫外檢測相比提高了22倍，而非特異性的標記僅占了1%，顯示了這種衍生方法極好的選擇性.

圖3 反應時間對核糖核酸酶b和細胞色素c衍生效果的影響Fig.3 Effect of reaction time on the derivatization of ribonuclease b and cytochrome c

圖4 核糖核酸酶b經ANTS標記熒光檢測a、熒光空白實驗b和紫外檢測c的色譜Fig.4 Chromatograms of ANTS labeled ribonuclease b with fluorescent detection a，fluorescence blank b，and UV-visible blank c

2.4 衍生蛋白質混合物

筆者進一步將ANTS應用于了蛋白質混合物的衍生.共選擇3個蛋白質，其中包括2個糖蛋白：核糖核酸酶b和伴清蛋白；1個非糖蛋白：細胞色素c.熒光試劑ANTS只能選擇性與糖蛋白質中多糖氧化后形成的醛基反應，因此理論上，通過ANTS標記和熒光檢測應該僅有2個色譜峰（分別代表糖核酸酶b和伴清蛋白）實現有效識別.如圖5a所示，只有核糖核酸酶b和伴清蛋白在熒光下得到了檢測；而細胞色素c為非糖蛋白不可能在熒光檢測下有響應信號，進一步說明了筆者發(fā)展的方法具有很好的選擇性.

2.5 選擇性卵清蛋白衍生

進一步將該方法應用于卵清蛋白提取產物的分析.如圖6所示，經過ANTS標記后，熒光檢測和紫外對照相比選擇性有很大的差異，其中熒光檢測靈敏的色譜峰筆者認為是糖蛋白.為了進一步驗證實驗，將衍生的蛋白質混合物用TiO2進行捕集，并采用微柱液相色譜串聯質譜進行了鑒定，共鑒定到14個蛋白質，其中，53%的蛋白質是已知的糖基化蛋白質，而超過85%的蛋白質具有一致的N-X-T／S（X為除脯氨酸以外的氨基酸）序列，因此它們是潛在的糖基化蛋白.以上結果進一步驗證了方法的高選擇性.

圖5 ANTS標記3種蛋白質混合物熒光檢測a和紫外檢測b色譜.Fig.5 Chromatograms of ANTS labeled 3-protein mixture with fluorescent detection a，and UV-visible blank b

圖6 ANTS標記卵清蛋白熒光檢測a和紫外檢測對照b色譜Fig.6 Chromatograms of ANTS labeled egg white proteins with fluorescent detection a and UV-visible control b

3 結論

發(fā)展了一種選擇性糖基化蛋白質衍生和熒光檢測的新方法.糖基化蛋白質多糖經氧化后形成的醛基在NaCNBH3存在條件下便可選擇性與熒光試劑ANTS結合，實現選擇性的糖蛋白標記和熒光檢測.在優(yōu)化的衍生條件下，將該方法應用于標準蛋白質混合物和卵清蛋白的衍生，實現了高選擇性的糖基化蛋白質衍生，有望在糖基化蛋白質選擇性識別領域發(fā)揮重要的作用.

［1］ CHEN Songming，LAROCHE T，HAMELINCK D，et al.Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays［J］.Nature Methods，2007，4（5）：437-444.

［2］ DENNIS J W，NABI I R，DEMETRIOU M.Metabolism，cell surface organization，and disease［J］.Cell，2009，139（7）：1229-1241.

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［4］ LI Hui，WANG Min，QIANG Weibing，et al.Metal-enhanced fluorescent detection for protein microarrays based on a silver plasmonic substrate［J］.Analyst，2014，139（7）：1653-1660.

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［7］ LEMOINE J，CABANES-MACHETEAU M，BARDOR M，et al.Analysis of 8-aminonaphthalene-1，3，6-trisulfonic acid labelled N-glycans by matrix-assisted laser desorption／ionisation time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2000，14（2）：100 -104.

（責任編輯：梁俊紅）

Research on 8-aminonaphthalene 1，3，6-trisulfonic acid disodium salt based fluorescent tag for selective glycoprotein labeling

QIN Xinying1，LI Rui2
（1.Chemical Biology Key Laboratory of Hebei Province，College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China；2.State Key Laboratory of Solid Waste Reuse for Building Materials，Beijing 100041，China）

The selective glycoprotein labeling method based on fluorescent tag 8-aminonaphthalene-1，3，6-trisulfonic acid disodium（ANTS）was developed in the present work.With proteins cytochrome c and ribonuclease b as the samples，the pH value and reaction time were optimized.The fluorescent detection sensitivity of glycoprotein ribonuclease b could be increased about 22-fold via ANTS labeling while the nonspecific labeling only 1%，indicating the good selectivity of the developed method.The method was further used for derivatization of egg white proteins.By combining with titanium dioxide（TiO2）for glycoproteins enrichment，totally 14proteins were identified，of which 85%proteins were recognized with the sequence N-X-T／S（X except Pro），as the potential glycoproteins，which further indicated the high selectivity of the developed method.All these results suggested the potential merits of the developed method for high specific glycoprotein recognition.

book=34,ebook=55

8-aminonaphthalene-1，3，6-trisulfonic acid disodium；glycoprotein；labeling；fluorescent detection

秦新英（1978-），男，河北邯鄲人，河北大學副教授，主要從事分析化學研究.E-mail：hbuqinxinying＠163.com

O658

A

1000 -1565（2014）05 -0497 -05

10.3969／j.issn.1000 -1565.2014.05.010

2014 -05 -20

國家自然科學基金資助項目（21205027）；河北省自然科學基金資助項目（B2012201052）；河北省教育廳科學技術研究發(fā)展項目（QN2014066）