參靈方對佐劑性關節炎大鼠胃黏膜損傷的保護機制研究

趙存方 張 竟 于榮屏

(中國人民解放軍白求恩國際和平醫院干部病房，河北 石家莊 050082)

1 中國人民解放軍北京軍區聯勤部石家莊第二離職工部休養所，河北 石家莊 050000

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周圍關節為主的多系統炎癥性自身免疫性疾病［1］，目前尚無特效治療藥物。RA可侵襲患者消化系統，且治療藥物也常可造成胃腸黏膜的損傷，使患者消化系統癥狀更加明顯，是影響RA患者長期治療的關鍵問題之一。本實驗研究擬通過建立佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型，然后在給予參靈方灌胃干預治療后，采用皮下注射吲哚美辛進一步誘導藥源性胃黏膜損傷的疾病模型，觀察大鼠胃黏膜組織的病理變化及胃黏膜細胞的凋亡情況，來探討參靈方對AA大鼠胃黏膜損傷的干預保護機制，為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠60只，雌雄各半，清潔級，體質量150～180g，由河北醫科大學動物實驗中心提供，合格證號:810146。

1.1.2 藥品及試劑 參靈方，主要藥物組成黨參、黃柏、五味子，中國人民解放軍白求恩國際和平醫院中藥房提供，取各等份中藥39 g，加水超出藥面2～3 cm，浸泡1 h，文火煎煮2次，每次40 min，濃縮成1 g/mL，冰箱保存備用;吲哚美辛(消炎痛)原藥粉，江蘇太倉制藥廠，批號:070713;鹽酸雷尼替丁膠囊，山西太原藥業有限公司，國藥準字H14022109，批號:070704;注射用卡介苗(50 mg/支)，上海生物制品研究所，批號:20090312;原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 YSQ-SG46-280S不銹鋼手提式高壓蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司;CS501型超級恒溫水浴，上海浦東榮豐科學儀器有限公司;Olympus顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社;CMIS-2011細胞醫學圖像分析系統，重慶天海醫療設備有限公司;Citadel2000脫水機，英國珊頓公司;YT-6B型烤片機，湖北孝亞光電子技術研究所;TMY-781B微波儀，浙江臨安電子儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立及分組 將60只大鼠隨機抽取10只作為空白對照組，其余50只采用配制好完全弗氏佐劑，按每只大鼠0.1 mL于右后足跖皮內注射制作AA模型。次日即可出現足部腫脹，第4 d腫脹達到高峰，然后逐漸減輕，第10 d再次腫脹，造模19 d后，將出現二次反應的大鼠隨機取30只，分為模型對照組、雷尼替丁對照組及參靈方組，每組10只。

1.2.2 灌胃給藥 造模19 d后，雷尼替丁對照組予鹽酸雷尼替丁膠囊30mg/(kg·d)灌胃;參靈方組予參靈方7 g/(kg·d)灌胃;空白對照組及模型對照組分別予等容積的0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠均灌胃28 d，于最后1次灌胃結束后各組大鼠禁食不禁水24 h，模型對照組、雷尼替丁對照組及參靈方組均腹部皮下注射吲哚美辛30 mg/Kg(溶于5%NaHCO3溶液中)進一步誘導藥源性胃黏膜損傷模型，7 h后采集標本。

1.2.3 觀察項目及方法

1.2.3.1 關節炎指數 觀察記錄各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后全身關節病變程度，按5級評分法評價［2］。0分:無紅腫;1分:有紅色斑點或輕度腫脹;2分:關節部位中度腫脹;3分:嚴重腫脹;4分:關節變形，不能負重)。關節炎指數=四肢關節評分之和。

1.2.3.2 標本的采集及處理 將各組大鼠麻醉后打開胸腔，剖腹，在食管與賁門部做雙重結扎，中間剪斷，首先用鑷子提起胃賁門部，切斷靠近賁門的食管，一邊牽拉，一邊切斷周圍韌帶，使胃同周圍組織分離，結扎幽門后剪斷，然后將胃取出，取胃后沿胃大彎側剪開胃腔，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗凈胃腔，在胃腺區的相同部位切取0.5 cm×1.0 cm組織塊，以大頭針放平固定在石蠟器皿上，放入4%多聚甲醛溶液中固定。光學顯微鏡觀察胃黏膜組織病理變化，TUNEL法檢測胃黏膜細胞凋亡情況.

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料用均數均數±標準差(±s)表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，方差分析前進行方差齊性檢驗，采用LSD法進行組間兩兩比較。

2 結果

2.1 各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后關節炎指數變化比較 見表1。

表1 各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后關節炎指數變化比較分，±s

表1 各組大鼠灌胃前及灌胃28 d后關節炎指數變化比較分，±s

與空白對照組比較，* P＜0.05

組 別 n 灌胃前 灌胃28 d后10 0 0模型對照組 10 15.31 ±1.43* 15.69 ±1.94*雷尼替丁對照組 10 14.38 ±1.91* 14.21 ±1.75*參靈方組 10 14.63 ±1.29* 13.09 ±1.13空白對照組*

由表1可見，灌胃前及灌胃28 d后模型對照組、雷尼替丁對照組及參靈方組關節炎指數與空白對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，說明AA大鼠模型復制成功。

2.2 各組大鼠胃黏膜病理學觀察 空白對照組大鼠胃黏膜結構層次清楚，上皮結構完整無損，腺體排列整齊(見封3，圖1);模型對照組大鼠胃黏膜上皮細胞明顯受損，脫落，上皮結構不完整，部分黏膜中斷，局部腺體結構紊亂，黏膜表面及腺腔內較多脫落的上皮細胞碎片(壞死區可見少量含鐵血黃素)及滲出物(可見大量炎性細胞浸潤)(見封3，圖2);參靈方組及雷尼替丁對照組大鼠胃黏膜局部上皮脫落較少，黏膜內血管充血，有少量炎細胞浸潤(見封 3，圖 3、圖 4)。

2.3 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況比較 見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況比較%，±s

表2 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況比較%，±s

與空白對照組比較，*P＜0.05;與模型對照組比較，△P＜0.05

組 別 n 細胞凋亡指數空白對照組10 5.65 ±0.72模型對照組 10 56.61 ±7.82*雷尼替丁對照組 10 38.63 ±5.67△參靈方組 10 32.39 ±4.62△

空白對照組大鼠胃黏膜凋亡細胞主要位于表面上皮細胞內，呈簇狀分布或單個散在分布，TUNEL陽性反應物質為棕黃色，位于細胞核內(濃縮的核質緊貼于核膜，或核質呈現均勻的染色)(見封3，圖5)。由表2可見，模型對照組胃黏膜細胞凋亡指數與空白對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，明顯增加(見封3，圖6);雷尼替丁對照組及參靈方組胃黏膜細胞細胞凋亡指數與模型對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，均明顯下降(見封3，圖7、圖8)，而雷尼替丁對照組與參靈方組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，說明2組均減少了AA大鼠的胃黏膜細胞凋亡，且療效相當。

3 討論

RA病因至今并不十分明了，在其發病過程中本身可造成消化系統損害。劉健等［3］研究表明，AA大鼠胃黏膜細胞超微結構病變率升高，表現為線粒體腫脹變性，棘突破壞和消失，胃黏膜細胞凋亡率高于正常組，這可能是RA患者胃黏膜損傷的原因之一。另外，抗風濕藥物也常引起的消化系統損害。國外研究人員調查發現，RA患者服用阿司匹林胃潰瘍發病率為80.6%，而正常人服用阿司匹林發病率僅為44.8%，且25%的藥物副作用報告是由非甾體抗炎藥(NSAIDs)引起［4-5］。

細胞凋亡是細胞程序性死亡方式，胃黏膜正常結構的維持有賴于上皮細胞凋亡與細胞增殖之間的動態消長平衡，細胞凋亡在胃黏膜損傷修復過程中起著重要的調控作用［6］，已證實正常胃黏膜細胞存在凋亡，這是一種以基因表達、DNA合成為特征的細胞主動死亡過程，在正常情況下，2種蛋白在胃黏膜都有表達并保持動態平衡，如細胞凋亡過度必將破壞胃黏膜的完整性，進而造成胃黏膜的損傷，因此細胞凋亡與增殖之間的失衡是胃黏膜損傷發生的重要因素，胃黏膜損傷與各種刺激導致胃黏膜上皮細胞的凋亡密切相關［7-8］。

參靈方為純中藥方劑，具有健脾益氣、和胃燥濕之功。方中黨參益氣健脾;黃柏清熱燥濕，解毒療瘡;五味子收斂固澀，益氣生津。有研究證實，黨參對胃黏膜具有較好的保護作用［9］，黨參注射液能夠上調超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的表達，提示黨參能抵抗氧自由基損傷，屬強抗氧化藥物［10］。復方黃柏液具有明顯的抗感染及促進傷口愈合的作用［11］。五味子具有抗損傷、抗氧化、抗潰瘍、抗應激及抑菌作用，去氧五味子素可抑制胃酸分泌，有顯著的抗潰瘍作用［12］。

本實驗結果表明，空白對照組大鼠胃黏膜結構層次清楚，上皮結構完整無損。模型組大鼠胃黏膜上皮細胞明顯受損，脫落，上皮結構不完整，胃黏膜細胞凋亡明顯增加。參靈方組大鼠經參靈方干預治療后，胃黏膜局部上皮脫落較少，凋亡指數也明顯下降，說明參靈方減少了AA大鼠吲哚美辛引起的胃黏膜細胞凋亡，其可能是通過增加細胞增殖、減少細胞凋亡而抑制胃黏膜細胞損傷，從而發揮胃黏膜保護作用。

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