Kiss-1對結腸癌SW480細胞增殖的影響

劉迪群，吳雪艷，鐘 華

（南華大學附屬第一醫院消化內科，湖南 衡陽 421001）

結腸癌是我國最常見的消化系統惡性腫瘤之一，其發病率位居第二位，僅次于胃癌，且近年呈現年輕化及上升趨勢。轉移作為惡性腫瘤的重要生物學特性之一，是涉及到多種生物分子參與的復雜過程，直接關系到腫瘤的分級及分期。目前由于腫瘤患者早期檢出率低，大部分患者明確診斷時已發生轉移，錯過了手術治療的最佳時期。作為腫瘤的輔助治療方式之一，放射治療對改善患者的5年生存率無明顯意義［1］。因此，早期診斷結腸癌對提高患者的生存率至關重要。Kiss-1是繼nm23之后，由Lee等［2］應用微細胞介導的染色體雜交技術及差減雜交技術在人黑色素瘤細胞株中發現的一種腫瘤轉移抑制基因，其定位于染色體1q32-q41，基因序列中包含4個外顯子，編碼的蛋白kisspeptin是由145個氨基酸組成的親水性多肽。有研究［3］表明Kiss-1基因與人黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌及腎細胞癌的轉移能力呈負相關，直接影響著腫瘤的侵襲與轉移。本研究在體外構建高表達Kiss-1的結腸癌SW480細胞株，旨在探討Kiss-1基因對結腸癌增殖的影響，為結腸癌患者創造新的治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株SW480由湘雅醫學院腫瘤研究所惠贈；質粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載質粒由上海吉凱公司合成，2種質粒均含有GFP綠色熒光，經測序鑒定無誤；質粒小提試劑盒為康為公司產品，脂質體轉染試劑盒Lipofectamine2000購自美國invitrogen公司，G418及CCK8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗人Kiss-1一抗購自武漢博士德生物工程有限公司、二抗購自美國Epitomics公司。

1.2 質粒擴增與提取

LB肉湯2.5 g加入100 mL一級水中配置成25 mg·mL-1的LB液態培養基，高溫蒸汽消毒備用。培養基中加入卡那霉素，使其終濃度為30 μg·mL-1。質粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載質粒各100 μL分別加入 5 mL LB 培養基中，37 ℃、180 r·min-1震蕩 16 h。提取純化質粒并進行瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計測量質粒濃度。

1.3 細胞培養、分組與轉染

將人結腸癌細胞株SW480培養于含10%胎牛血清的1640培養基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養，細胞生長至90%～95%融合度時將其隨機分為3組。1）空白對照組未進行轉染。2）實驗組用pEGFP-N1-Kiss-1進行轉染:用無血清1640培養基將 8 μg pEGFP-N1-Kiss-1 質粒和 10 μL Lipofectamine2000分別稀釋至總體積為250 μL，室溫下靜置5 min；輕輕混勻2種溶液，室溫下靜置20 min，將混合液加入SW480細胞中，37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養6 h；吸去培養基，PBS液洗2遍，加入含10%胎牛血清的1640培養基終止轉染；42 h 后更換完全培養基，加入 500 μg·mL-1G418篩選，培養3～4 d待細胞大量死亡時，降低濃度至300 μg·mL-1維持篩選4周左右，獲得穩定轉染細胞。3）陰性對照組用空載體pEGFP-N1進行轉染，方法同實驗組。

1.4 Western-blot鑒定Kiss-1在SW480細胞中的表達

分別提取空白對照組、陰性對照組及實驗組中SW480細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定各組樣本蛋白濃度，用15%SDS聚丙烯酰胺凝膠跑電泳，每孔上樣蛋白量為30 μg，半干轉至 PVDF膜，麗春紅染色驗證后用含5%血清的TBST封閉，依次結合對應一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗，最后暗室曝光顯像，檢測Kiss-1表達的變化。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖情況

已處對數生長期的各組細胞用0.25%胰酶消化，制成細胞懸液接種于 96孔板內（2×103孔-1）定容至100 μL培養，每組細胞設3個復孔，同時設置3個空白孔（只含細胞培養基）。分別于0、24、48及72 h每孔加入5 μL CCK-8溶液，5%CO2及飽和濕度培養基繼續孵育2 h，檢測450 nm光譜下的吸光度，根據每天吸光值的均數繪制細胞生長曲線。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 SW480細胞轉染質粒及篩選

SW480細胞轉染質粒后24 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞，可見綠色熒光。經過4周的G418篩選，G418 維持濃度為 300 μg·mL-1，視野里幾乎所有細胞都帶有綠色熒光蛋白。停用G4181周，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光基本保持不變。穩定轉染細胞株篩選成功。

2.2 Kiss-1在SW480細胞中的表達

Kiss-1在空白對照組、陰性對照組與實驗組中的表達見圖1，結果顯示:Kiss－1在實驗組中高表達，而在空白對照組及陰性對照組中低表達，3組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結果提示，Kiss－1 基因在SW480－Kiss－1細胞中能穩定、高效地表達。

圖1 穩定轉染后Western－blot檢測Kiss－1在SW480細胞中的表達

2.3 Kiss-1對SW480細胞增殖的影響

3組培養各時段SW480細胞數比較見表1，3組SW480細胞生長曲線見圖2。結果顯示:培養0、24 h時各組SW480細胞數差異無統計學意義（P＞0.05），48 h 后，隨著培養時間延長，實驗組 SW480細胞數明顯低于空白對照組與陰性對照組（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組SW480細胞數差異無統計學意義（P＞0.05）。 結果提示，Kiss－1 可抑制SW480細胞的增殖。

表1 3組培養各時段SW480細胞數比較 ，×104個

表1 3組培養各時段SW480細胞數比較 ，×104個

﹡P＜0.05 與實驗組比較。

組別 n 0 h 24 h 48 h 72 h實驗組 3 1.16±0.07 1.62±0.16 2.61±0.14 3.62±0.01空白對照組 3 1.12±0.06 2.28±0.19 4.53±0.46*6.52±0.49*陰性對照組 3 1.10±0.05 2.19±0.11 4.22±0.45*6.21±0.30*

圖2 3組SW480細胞生長曲線

3 討論

腫瘤轉移是一個涉及到腫瘤細胞與宿主細胞相互作用的多級過程。腫瘤細胞從原發腫瘤中分離，經血循環及淋巴循環系統轉移至遠處，黏附于內皮細胞、分解基質、外滲，最終在轉移部位無限制增殖，導致轉移性腫瘤發生［4］。多種癌基因與抑癌基因參與腫瘤的發生與發展過程。Kiss－1是近來頗受關注的一種腫瘤轉移抑制基因，其在多種人體組織中發揮轉移抑制作用［5］。它的基因結構由4個外顯子區域組成，外顯子Ⅰ與外顯子Ⅱ為非編碼區，外顯子Ⅲ的結構依次為翻譯起始位點、38個非編碼堿基及103個編碼堿基，外顯子Ⅳ含335個翻譯堿基、翻譯終止點、多腺苷酸化信號和121個非編碼堿基［3］。Kisspeptin作為一種145個氨基酸殘基組成的親水性多肽進一步水解成多種小分子多肽，其中一種水解產物kisspeptin－54又名metastin，是G－蛋白偶聯受體的配體。Ringel等［6］發現Metastin及其受體有著調節甲狀腺癌細胞生物學活性的作用。在轉移性膀胱癌組織中，Kiss－1的表達水平明顯低于淺表膀胱癌［7］。研究表明相對于Kiss－1高水平表達的胃癌患者，低表達患者更容易發生遠處轉移和復發，且其死亡率明顯增高［8］。 可見，Kiss－1 表達水平高者，腫瘤發展慢，預后好。

本研究結果發現，Kiss－1重組質粒轉染SW480細胞后，SW480細胞的體外增殖能力從細胞周期的48 h開始明顯下降，差異有統計學意義。因此，推測Kiss－1基因能有效抑制結腸癌SW480細胞的增殖能力，從而影響結腸癌的發展。但其具體作用機制有待進一步研究證明，以便為今后結腸癌患者的早期診斷及靶向基因治療提供理論依據。

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