低溫脅迫對兩種紫花苜蓿膜脂脂肪酸含量的影響

王 柏，苑芷茜，李東雙，李志堅

（1. 東北師范大學草地科學研究所，植被生態科學教育部重點實驗室，吉林 長春130024；2. 吉林師范大學生態環境研究所，吉林 四平136000）

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上廣泛栽培的優良豆科牧草。近年來從國內外苜蓿品種在我國北方地區的引種試驗和生產實踐來看，國內外大多數優良苜蓿品種均存在生態不適應性問題，即在我國北方冬季氣候干旱寒冷地區種植，其抗寒性、持久性表現較差。因此，選擇抗寒性強的苜蓿品種是我國北方地區苜蓿成功建植的關鍵。

植物細胞膜的結構和穩定與植物抗寒性有著密切關系，一直是植物抗寒生理生態學的重點研究內容之一。Lyons 最早發現高抗寒植物較不抗寒植物具更高的不飽和脂肪酸含量[1]，除了受遺傳特性的控制以外，外界的溫度條件也能在一定程度上影響植物的脂肪酸不飽和度。大量研究表明，不飽和脂肪酸的含量隨溫度的降低而增加，在不飽和脂肪酸不斷積累的過程中，植株的抗寒性也不斷增強。品種間的抗寒性差異亦是在此低溫期間表現出來的，即脂肪酸不飽和度高的植物抗寒性強于脂肪酸不飽和度低的植物[2-4]。同種植物即便取材于不同時期、不同部位，也能得此結論[5-7]。因此，可以通過適當的低溫鍛煉來提高植物的抗寒力。

苜蓿抗寒性很大程度取決于根頸對寒冷的忍耐力，有關苜蓿根頸抗寒的研究已有少量報道，而目前有關苜蓿膜脂脂肪酸與抗寒性的關系的研究主要是以苜蓿的幼苗及葉片為對象[8-10]，關于低溫對根頸膜脂脂肪酸影響的文獻未見報道。為了解苜蓿膜脂脂肪酸含量與抗寒性的關系，試驗選用兩種抗寒性不同的苜蓿品種，經自然低溫處理后，對其根頸膜脂脂肪酸含量及其組分進行定量分析，以期為苜蓿抗寒種質資源鑒定、評價以及苜蓿抗寒品種選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的準備和處理

供試苜蓿品種為WL-525HQ 苜蓿（極不抗寒）和肇東苜蓿（抗寒）。于2009年5月1 在東北師范大學試驗地進行盆栽。花盆中裝入過篩土壤，均勻播種，每個品種播種15 盆，每盆為一個重復。定期灌水、除草，9月初刈割一次。

10月下旬起，記錄每日日平均氣溫，在氣溫不斷下降的過程中取樣。當連續7 d 的日平均氣溫平均值達0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃時取樣，每品種3 次重復。樣品經液氮迅速冷凍后，放入超低溫冰箱中保存。室內試驗在東北師范大學草地科學研究所實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 膜脂的提取 將根頸剪碎混勻，取3 g 樣品放入研缽用液氮研磨成粉，用氯仿-甲醇混合溶液進行膜脂提取。再加1%的NaCl 溶液將有機相充分洗滌后，水浴蒸干，即可得總脂。

1.2.2 極性脂的提取 根據液-液分離法，用石油醚反復沖洗去除中性脂，得到不含中性脂的極性脂溶液，水浴蒸干后得極性脂。

1.2.3 膜脂的甲酯化 用KOH-甲醇溶液法對干燥后的極性脂肪酸進行甲酯化，將上層清液直接進行氣相色譜分析[11]。

1.2.4 膜脂中脂肪酸成分分析 采用Agilent6890 氣相色譜儀進行脂肪酸成分的分析，柱溫采用程序升溫：150℃維持2 min，以15℃/min 升至240℃，維持5 min，汽化室250℃，檢測室250℃。按照峰面積歸一化法計算求得各脂肪酸在總脂中的相對含量。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下苜蓿根頸膜脂脂肪酸組成與其含量變化

WL-525HQ 苜蓿與肇東苜蓿根頸膜脂脂肪酸主要由棕櫚酸（16︰0）、硬脂酸（18︰0）、油酸（18︰1）、亞油酸（18︰2）、亞麻酸（18︰3）組成。這5種脂肪酸占總膜脂脂肪酸的95%以上。各樣本脂肪酸組成相同，但在不同溫度處理下品種間含量配比存在差異（表1）。其中，飽和脂肪酸中以棕櫚酸為主，占根頸總膜脂脂肪酸的12.09%～19.03%；不飽和脂肪酸中亞油酸為主，占根頸總膜脂脂肪酸的56.33%～68.17%，其次為亞麻酸，所占比例為14.28%～19.50%。

從整個低溫過程中脂肪酸的變化幅度來分析，以棕櫚酸與亞油酸的變幅最大，WL-525HQ 苜蓿中棕櫚酸下降了2.60個百分點，亞油酸上升了4.57個百分點；肇東苜蓿中棕櫚酸下降了5.44個百分點，亞油酸上升了5.09個百分點。且WL-525HQ 苜蓿中棕櫚酸含量始終高于肇東苜蓿的，亞油酸含量則相反。這說明這兩種脂肪酸對低溫反應較為敏感；而硬脂酸、油酸、亞麻酸的變幅均較小，則說明這3種脂肪酸對低溫反應不敏感。

2.2 低溫脅迫下苜蓿根頸膜脂不飽和脂肪酸含量及IUFA 值的變化

由表2 可知，WL-525HQ 苜蓿與肇東苜蓿的根頸膜脂不飽和脂肪酸含量與IUFA 值隨處理溫度的降低均有不同程度的增加。對兩種苜蓿根頸膜脂不飽和脂肪酸含量與溫度進行相關性分析，結果顯示WL-525HQ 苜蓿的不飽和脂肪酸含量與溫度的相關系數為-0.969，呈極顯著負相關（P＜0.01），肇東苜蓿的不飽和脂肪酸含量與溫度的相關系數為-0.942，呈顯著負相關（P＜0.05）；WL-525HQ 苜蓿與肇東苜蓿根頸膜脂中IUFA 值與溫度的相關系數分別為-0.944 與-0.928，兩個品種根頸膜脂中IUFA 值均與溫度呈顯著負相關（P＜0.05）。

從表3 中可看出，低溫脅迫下，五種主要脂肪酸中亞油酸（18︰2）和棕櫚酸（16︰0）的含量與兩種苜蓿根頸膜脂不飽和脂肪酸的百分含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著相關（P＜0.01），其中亞油酸（18︰2）含量與苜蓿膜脂脂肪酸不飽和度呈顯著正相關，棕櫚酸（16︰0）含量與苜蓿膜脂脂肪酸不飽和度呈極顯著負相關（P＜0.01），而其他三種脂肪酸與苜蓿根頸不飽和脂肪酸百分含量沒有顯著相關性。同時，亞油酸與棕櫚酸是苜蓿根頸膜脂中相對含量最多的兩種脂肪酸。

表2 低溫脅迫下苜蓿根頸膜脂不飽和脂肪酸含量及IUFA 值的變化

2.3 低溫脅迫下苜蓿根頸膜脂脂肪酸組分與抗寒性的關系

表3 脂肪酸組分與不飽和脂肪酸百分含量之間相關的矩陣

目前普遍認為，不飽和脂肪酸含量越高，植物抗寒性越強。沈漫[12]認為，高抗寒植物之所以具有較多的不飽和脂肪酸，除自身遺傳特性決定外，能相對快速的合成大量不飽和脂肪酸以適應低溫環境。從表2 中可看到，兩個品種的不飽和脂肪酸含量和IUFA 值兩個指標在初始溫度（0℃）的數值為最低，隨溫度的降低逐漸上升，均于-20℃達到最高。WL-525HQ 苜蓿的不飽和脂肪酸含量上升幅度達3.75%，肇東苜蓿上升幅度達6.53%；WL-525HQ 苜蓿的IUFA 值上升幅度達2.35%，肇東苜蓿的上升幅度達到5.51%。肇東苜蓿兩個指標的上升幅度均大于WL-525HQ 苜蓿，并且在-5℃～-20℃下，兩品種間的差異達顯著水平（P＜0.05）。肇東苜蓿自身的不飽和脂肪酸含量以及低溫下優先積累不飽和脂肪酸的能力均高于WL-525HQ 苜蓿。整個低溫處理過程中，肇東苜蓿的根頸膜脂脂肪酸不飽和度與IUFA 值均高于WL-525HQ 苜蓿。由此可以推斷，肇東苜蓿的抗寒性大于WL-525HQ 苜蓿，與多年田間凍害觀測結果相一致。

3 結論與討論

苜蓿根頸膜脂脂肪酸的組分隨溫度的變化而產生相應的規律性變化，隨溫度的下降，兩個苜蓿品種的脂肪酸不飽和度與IUFA 值都有不同程度的上升，并均與溫度呈顯著或極顯著負相關。證實了低溫有助于苜蓿根頸膜脂不飽和脂肪酸的形成。

鑒定植物的抗寒能力除需要適當的研究方法，還需在適當方法之上建立正確的量化指標。通過前人的研究成果可總結出脂肪酸不飽和度、IUFA 值及一些與溫度高度相關的脂肪酸都可以作為植物的耐寒性指標[13-15]。根據脂肪酸不飽和度與IUFA 值在低溫下的變化對苜蓿抗寒性進行的綜合評估，得出肇東苜蓿的抗寒性大于WL-525HQ 苜蓿，與多年的田間實驗結果相一致。這也確定了脂肪酸不飽和度與IUFA 值均可作為評價苜蓿抗寒性的生理指標，并驗證通過了盆栽試驗鑒定苜蓿抗寒性代替傳統的田間凍害觀測的可行性。

亞油酸（18︰2）和棕櫚酸（16︰0）不僅是苜蓿根頸膜脂脂肪酸中含量最多的兩類，低溫脅迫條件下，還與苜蓿根頸膜脂脂肪酸不飽和度顯著相關。因此，亞油酸和棕櫚酸含量的變化決定著苜蓿根頸膜脂脂肪酸的不飽和度。亞油酸含量增多，脂肪酸不飽和度增大；棕櫚酸增多，脂肪酸不飽和度減小。因此，亞油酸和棕櫚酸要比其他不飽和膜脂脂肪酸在苜蓿抗寒性方面的貢獻更大，可以作為紫花苜蓿膜脂抗寒指示性脂肪酸。

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