冰凍亞型紅細(xì)胞制備及使用的全程質(zhì)量控制

王林　唐玉清　閆曉鵬等

[摘要] 目的 對冰凍亞型紅細(xì)胞制備及使用的全過程進(jìn)行質(zhì)量控制，保證其在血型血清學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用效果。 方法 對起始血液進(jìn)行選擇，對紅細(xì)胞甘油化、冰凍保存、融化復(fù)溫、去甘油化等一系列操作程序進(jìn)行規(guī)范化，對制備好紅細(xì)胞的保存介質(zhì)、保存溫度以及保存時(shí)間進(jìn)行明確規(guī)定并嚴(yán)格執(zhí)行。 結(jié)果 用優(yōu)化選擇的試驗(yàn)參數(shù)制備冰凍亞型紅細(xì)胞，融化洗滌后紅細(xì)胞上清液的FHb含量、甘油殘留量及紅細(xì)胞抗原反應(yīng)性的檢測結(jié)果均符合預(yù)期要求；在規(guī)定的有效期內(nèi)，紅細(xì)胞性能穩(wěn)定，使用效果良好。 結(jié)論 對冰凍亞型紅細(xì)胞制備及使用的全過程進(jìn)行質(zhì)量控制，可保證其在工作中的應(yīng)用效果，提高本地區(qū)無償獻(xiàn)血者及臨床患者的ABO亞型檢出率，保證臨床輸血的安全性和有效性。

[關(guān)鍵詞] 冰凍亞型紅細(xì)胞；質(zhì)量控制

[中圖分類號] R318.52 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）17-136-03

[Abstract] Objective To conduct whole-course quality control over preparation and application of frozen red blood cells to ensure its effect in blood group serology test. Methods Selecting the original blood， conducting standardized procedures including glycerinating， frozen preservation， melting and rewarming， glycerin elimination of the red blood cells， and developing and strictly implementing specific regulations on the preservation medium， temperature and time of the prepared red blood cells. Results The test results of FHb content and residual glycerin in the red blood cell supernatant and antigenic reactivity of red blood cells met expected requirements after preparing frozen red blood cells based on optimized test parameters， and melting and washing red blood cells. The red blood cells demonstrated stable functions and good effects in the period of validity. Conclusion Whole-course quality control over preparation and application of frozen red blood cells can ensure its effects， improve ABO subtype detection rate among voluntary donors and clinical patients in the local area and ensure the safety and effectiveness of clinical transfusion.

[Key words] Froze red blood cell； Quality control

冰凍紅細(xì)胞是借助冷凍保護(hù)劑（甘油）在低溫下保存紅細(xì)胞，從而降低紅細(xì)胞代謝率，達(dá)到延長紅細(xì)胞體外保存壽命的一種方法。目前主要應(yīng)用于RhD陰性等稀有血型血液的冰凍保存[1-3]。近年來，本研究利用該原理，將日常工作中遇到的ABO亞型血液（或標(biāo)本）進(jìn)行冰凍保存，并作為弱陽性參考品用于本站單克隆抗血清試劑的質(zhì)量選擇及進(jìn)貨驗(yàn)證；作為弱陽性質(zhì)控品用于本站無償獻(xiàn)血者及醫(yī)院供血庫ABO血型鑒定的室內(nèi)質(zhì)控；作為弱陽性標(biāo)本用于對醫(yī)院供血庫進(jìn)行ABO血型鑒定質(zhì)量測評、輸血技能比武及輸血技能培訓(xùn)等工作中，有效提高了無償獻(xiàn)血者及臨床患者的ABO亞型檢出率，促進(jìn)了臨床輸血的安全性和有效性。但冰凍亞型紅細(xì)胞在制備及使用的不同環(huán)節(jié)，存在許多影響

紅細(xì)胞質(zhì)量的不利因素，因此，本研究對其制備及使用的全過程進(jìn)行質(zhì)量控制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

57.1%復(fù)方甘油溶液、9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9% Nacl注射液、抗-A、抗-B、血漿轉(zhuǎn)移袋（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；1.6% Nacl溶液（由9%和0.9% Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測定試劑盒（北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團(tuán)有限公司）；鎢酸鈉（昆山興邦鎢鉬科技有限公司）；過典酸鈉（唐山寶齊試劑有限公司）；無抗凝劑的真空采血管、PVC冷凍管、一次性塑料吸管（浙江拱東醫(yī)療科技有限公司）；一次性輸血器、一次性注射器（河南曙光醫(yī)療器械集團(tuán)）；Eppendorf移液器（上海富眾生物科學(xué)有限公司）；KS-II型康氏震蕩儀（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫(yī)療儀器廠）；LD5-2A型臺式離心機(jī)（北京雷勃爾公司）；COBE2991TM1型血細(xì)胞淘洗機(jī)（美國COBE血液技術(shù)公司）；Cryafugedessi型大容量低溫離心機(jī)（德國賀利氏公司）。

1.2 冰凍亞型紅細(xì)胞制備過程的質(zhì)量控制方法

1.2.1 起始血液的選擇 （1）采集時(shí)間<6d。（2）無溶血和脂血。（3）HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP等傳染性指標(biāo)檢測均為陰性。

1.2.2 紅細(xì)胞甘油化 （1）濃縮紅細(xì)胞的制備：將起始血液按RCF1600g，離心10min，或1280g，離心18min，分離出濃縮紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞壓積控制在 （0.75±0.05）[4]。（2）添加甘油：①稱取需要甘油化紅細(xì)胞的重量，按終濃度40% [5]計(jì)算甘油添加量。②甘油的添加速度控制在8～10mL/min。③甘油化震蕩頻率控制在90～100次/min。④添加完畢室溫靜止平衡30min。（3）冰凍保存：①將室溫平衡過的甘油化紅細(xì)胞以RCF1250g，離心10min，去除多余的水分和甘油，使甘油化紅細(xì)胞的壓積保持在（0.60±0.05）[5]。②分裝、標(biāo)記后，置-80℃超低溫冰箱中儲存，冷凍過程中避免翻動(dòng)尚未凍結(jié)的紅細(xì)胞。

1.2.3 紅細(xì)胞融化及去甘油化 （1）紅細(xì)胞融化：將冰凍紅細(xì)胞從低溫冰箱中取出，迅速投入37℃水浴箱中，不斷輕輕搖動(dòng)，使紅細(xì)胞在5min內(nèi)迅速融化，繼續(xù)復(fù)溫至紅細(xì)胞表面溫度達(dá)（20±2）℃[6]。（2）紅細(xì)胞洗滌去除甘油：①用9%NaCl溶液洗滌1次，加入量為紅細(xì)胞標(biāo)計(jì)量的1/2，加入速度40～50mL/min，震蕩頻率90～100次/min， 靜止平衡5min， 以RCF1250g，離心10min，去上清。②用1.6%NaCl溶液洗滌1次，加入量和紅細(xì)胞標(biāo)計(jì)量相同，加入速度40～50mL/min，震蕩頻率90～100次/min， 靜止平衡5min， 以RCF1250g，離心10min，去上清。③用0.9%NaCl溶液洗滌2次，根據(jù)容器大小以最大量加入，加入速度和震蕩頻率也可適當(dāng)加快，每次均靜止平衡5min， 以RCF1250g，離心10min，去上清。④按壓積紅細(xì)胞的1.5倍加入保存介質(zhì)。

1.2.4 紅細(xì)胞制備質(zhì)量的檢測 （1）紅細(xì)胞的生化指標(biāo)檢測[6-8]：用鄰甲聯(lián)苯胺法測定上清FHb，應(yīng)≤1g/L；用過碘酸鈉法測定甘油殘留量，應(yīng)≤10g/L。（2） 紅細(xì)胞抗原穩(wěn)定性檢測：用鹽水試管法檢測紅細(xì)胞的A、B抗原，和冰凍前檢測結(jié)果應(yīng)一致。

1.3 冰凍亞型紅細(xì)胞使用過程的質(zhì)量控制方法

1.3.1 紅細(xì)胞保存 （1）按壓積紅細(xì)胞的1.5倍加入保存液懸浮。作為本站無償獻(xiàn)血者和醫(yī)院供血庫ABO血型鑒定室內(nèi)質(zhì)控品時(shí)，用MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)；作為醫(yī)院供血庫質(zhì)量測評、輸血技能及輸血技能培訓(xùn)標(biāo)本時(shí)，加入和紅細(xì)胞同時(shí)冰凍保存的原始血漿作為保存介質(zhì)；用于對單克隆抗血清試劑進(jìn)行質(zhì)量評估和選擇時(shí)，用MAP和血漿均可作為保存介質(zhì)。（2）按終濃度為0.05mg/mL的比例加入硫酸慶大霉素抑菌劑，混勻后分裝貼簽，2～6℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 確定紅細(xì)胞保存效期 觀察紅細(xì)胞在保存過程中FHb和A、B抗原的變化，以紅細(xì)胞每天置室溫1h再恢復(fù)2～6℃儲存的模式下，F(xiàn)Hb濃度達(dá)1.0g/L，同時(shí)紅細(xì)胞血型抗原減弱達(dá)1+的最小儲存天數(shù)再減10d作為其使用效期。

1.3.3 紅細(xì)胞使用 （1）每次使用前，將紅細(xì)胞置于室溫平衡15～30min，用完后立即放回2～6℃冰箱保存，每天置于室溫時(shí)間應(yīng)≤1h。（2）每次使用前必須檢查紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)溶血、顏色變化、細(xì)菌污染等，即放棄使用并更換新的紅細(xì)胞。（3）紅細(xì)胞必須在規(guī)定的有效期內(nèi)使用。以MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)時(shí)的有效期規(guī)定為40d；以血漿作為保存介質(zhì)時(shí)的有效期規(guī)定為20d。

2 結(jié)果

用上述優(yōu)化選擇的試驗(yàn)參數(shù)制備冰凍亞型紅細(xì)胞，紅細(xì)胞融化洗滌后上清液的FHb含量、甘油殘留量及紅細(xì)胞抗原反應(yīng)性檢測結(jié)果均符合預(yù)期要求；在規(guī)定的有效期內(nèi)，紅細(xì)胞性能穩(wěn)定，使用效果良好。

3 討論

ABO亞型在人群中的比例約為1.50/萬[9]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RhD陰性在人群中0.3%～0.5%[10]的比例。所以，只有將其冰凍保存才能得到有效利用。在制備過程中，紅細(xì)胞甘油化和去甘油化是影響紅細(xì)胞質(zhì)量的重要因素。甘油化是紅細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境從低滲到高滲的過程，因此，在滴加甘油時(shí)要緩慢均勻，結(jié)合一定頻率的震蕩及一定時(shí)間的平衡，使甘油充分?jǐn)U散、滲透入紅細(xì)胞。計(jì)算甘油添加量時(shí)，應(yīng)充分考慮細(xì)胞內(nèi)水，根據(jù)紅細(xì)胞懸液重量、密度、壓積等參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，以保證甘油終濃度達(dá)到40%，從而減少冰晶對紅細(xì)胞的損傷。去甘油化和甘油化正好相反，是紅細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境從高滲到低滲的過程，因此，在加入梯度NaCl溶液時(shí)也要緩慢均勻，同時(shí)進(jìn)行一定的震蕩和平衡，加快甘油從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓逐漸降低到和生理鹽水的滲透壓相同，從而減少因滲透壓過快降低而導(dǎo)致的紅細(xì)胞損傷。如果在冰凍前去除甘油化紅細(xì)胞中多余的水分和甘油，則可節(jié)省去甘油過程中甘油從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外滲出平衡的時(shí)間，從而縮短去甘油化過程，進(jìn)一步減少紅細(xì)胞損傷。

洗滌去除甘油的亞型紅細(xì)胞在保存使用過程中，紅細(xì)胞的保存介質(zhì)和保存溫度最為關(guān)鍵。因?yàn)榧t細(xì)胞沒有細(xì)胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產(chǎn)生ATP的同時(shí)，也會產(chǎn)生乳酸和丙酮酸等代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物如果在人體內(nèi)可被其他組織氧化利用，而在人體外卻因得不到充分利用而使其PH下降，而PH過低時(shí)會引起ATP從紅細(xì)胞中的釋放速率加快，導(dǎo)致紅細(xì)胞ATP耗竭，從而使紅細(xì)胞發(fā)生裂解 [11-13]。不但使細(xì)胞內(nèi)的Hb游離出細(xì)胞外，而且嚴(yán)重影響紅細(xì)胞血型抗原成分的穩(wěn)定性。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細(xì)胞保存液作為保存介質(zhì)，在一定時(shí)間內(nèi)，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細(xì)胞提供足夠的能量，中間含有的甘露醇還具有抵抗紅細(xì)胞溶解和加固細(xì)胞膜的作用，所以能有效維持紅細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，保證其使用質(zhì)量和效果。同時(shí)，血液作為一種熱敏物質(zhì)，對溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細(xì)胞代謝速率越快，能量消耗越多，隨著保存介質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗以及代謝產(chǎn)物的逐漸堆積，會進(jìn)一步加重紅細(xì)胞的儲存損傷，繼而使紅細(xì)胞裂解死亡。所以，我們通過試驗(yàn)觀察，對冰凍亞型紅細(xì)胞融化洗滌后的保存溫度及保存時(shí)間進(jìn)行了具體規(guī)定并嚴(yán)格執(zhí)行，從而保證了冰凍亞型紅細(xì)胞在血型血清學(xué)試驗(yàn)中的使用效果。

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（收稿日期：2014-04-28）