冰凍亞型紅細胞制備及使用的全程質量控制

王林　唐玉清　閆曉鵬等

[摘要] 目的 對冰凍亞型紅細胞制備及使用的全過程進行質量控制，保證其在血型血清學試驗中的應用效果。 方法 對起始血液進行選擇，對紅細胞甘油化、冰凍保存、融化復溫、去甘油化等一系列操作程序進行規范化，對制備好紅細胞的保存介質、保存溫度以及保存時間進行明確規定并嚴格執行。 結果 用優化選擇的試驗參數制備冰凍亞型紅細胞，融化洗滌后紅細胞上清液的FHb含量、甘油殘留量及紅細胞抗原反應性的檢測結果均符合預期要求；在規定的有效期內，紅細胞性能穩定，使用效果良好。 結論 對冰凍亞型紅細胞制備及使用的全過程進行質量控制，可保證其在工作中的應用效果，提高本地區無償獻血者及臨床患者的ABO亞型檢出率，保證臨床輸血的安全性和有效性。

[關鍵詞] 冰凍亞型紅細胞；質量控制

[中圖分類號] R318.52 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）17-136-03

[Abstract] Objective To conduct whole-course quality control over preparation and application of frozen red blood cells to ensure its effect in blood group serology test. Methods Selecting the original blood， conducting standardized procedures including glycerinating， frozen preservation， melting and rewarming， glycerin elimination of the red blood cells， and developing and strictly implementing specific regulations on the preservation medium， temperature and time of the prepared red blood cells. Results The test results of FHb content and residual glycerin in the red blood cell supernatant and antigenic reactivity of red blood cells met expected requirements after preparing frozen red blood cells based on optimized test parameters， and melting and washing red blood cells. The red blood cells demonstrated stable functions and good effects in the period of validity. Conclusion Whole-course quality control over preparation and application of frozen red blood cells can ensure its effects， improve ABO subtype detection rate among voluntary donors and clinical patients in the local area and ensure the safety and effectiveness of clinical transfusion.

[Key words] Froze red blood cell； Quality control

冰凍紅細胞是借助冷凍保護劑（甘油）在低溫下保存紅細胞，從而降低紅細胞代謝率，達到延長紅細胞體外保存壽命的一種方法。目前主要應用于RhD陰性等稀有血型血液的冰凍保存[1-3]。近年來，本研究利用該原理，將日常工作中遇到的ABO亞型血液（或標本）進行冰凍保存，并作為弱陽性參考品用于本站單克隆抗血清試劑的質量選擇及進貨驗證；作為弱陽性質控品用于本站無償獻血者及醫院供血庫ABO血型鑒定的室內質控；作為弱陽性標本用于對醫院供血庫進行ABO血型鑒定質量測評、輸血技能比武及輸血技能培訓等工作中，有效提高了無償獻血者及臨床患者的ABO亞型檢出率，促進了臨床輸血的安全性和有效性。但冰凍亞型紅細胞在制備及使用的不同環節，存在許多影響

紅細胞質量的不利因素，因此，本研究對其制備及使用的全過程進行質量控制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

57.1%復方甘油溶液、9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9% Nacl注射液、抗-A、抗-B、血漿轉移袋（上海血液生物醫藥有限責任公司）；1.6% Nacl溶液（由9%和0.9% Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測定試劑盒（北京瑞爾達生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團有限公司）；鎢酸鈉（昆山興邦鎢鉬科技有限公司）；過典酸鈉（唐山寶齊試劑有限公司）；無抗凝劑的真空采血管、PVC冷凍管、一次性塑料吸管（浙江拱東醫療科技有限公司）；一次性輸血器、一次性注射器（河南曙光醫療器械集團）；Eppendorf移液器（上海富眾生物科學有限公司）；KS-II型康氏震蕩儀（上海躍進醫療器械廠）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫療儀器廠）；LD5-2A型臺式離心機（北京雷勃爾公司）；COBE2991TM1型血細胞淘洗機（美國COBE血液技術公司）；Cryafugedessi型大容量低溫離心機（德國賀利氏公司）。

1.2 冰凍亞型紅細胞制備過程的質量控制方法

1.2.1 起始血液的選擇 （1）采集時間<6d。（2）無溶血和脂血。（3）HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP等傳染性指標檢測均為陰性。

1.2.2 紅細胞甘油化 （1）濃縮紅細胞的制備：將起始血液按RCF1600g，離心10min，或1280g，離心18min，分離出濃縮紅細胞，使紅細胞壓積控制在 （0.75±0.05）[4]。（2）添加甘油：①稱取需要甘油化紅細胞的重量，按終濃度40% [5]計算甘油添加量。②甘油的添加速度控制在8～10mL/min。③甘油化震蕩頻率控制在90～100次/min。④添加完畢室溫靜止平衡30min。（3）冰凍保存：①將室溫平衡過的甘油化紅細胞以RCF1250g，離心10min，去除多余的水分和甘油，使甘油化紅細胞的壓積保持在（0.60±0.05）[5]。②分裝、標記后，置-80℃超低溫冰箱中儲存，冷凍過程中避免翻動尚未凍結的紅細胞。

1.2.3 紅細胞融化及去甘油化 （1）紅細胞融化：將冰凍紅細胞從低溫冰箱中取出，迅速投入37℃水浴箱中，不斷輕輕搖動，使紅細胞在5min內迅速融化，繼續復溫至紅細胞表面溫度達（20±2）℃[6]。（2）紅細胞洗滌去除甘油：①用9%NaCl溶液洗滌1次，加入量為紅細胞標計量的1/2，加入速度40～50mL/min，震蕩頻率90～100次/min， 靜止平衡5min， 以RCF1250g，離心10min，去上清。②用1.6%NaCl溶液洗滌1次，加入量和紅細胞標計量相同，加入速度40～50mL/min，震蕩頻率90～100次/min， 靜止平衡5min， 以RCF1250g，離心10min，去上清。③用0.9%NaCl溶液洗滌2次，根據容器大小以最大量加入，加入速度和震蕩頻率也可適當加快，每次均靜止平衡5min， 以RCF1250g，離心10min，去上清。④按壓積紅細胞的1.5倍加入保存介質。

1.2.4 紅細胞制備質量的檢測 （1）紅細胞的生化指標檢測[6-8]：用鄰甲聯苯胺法測定上清FHb，應≤1g/L；用過碘酸鈉法測定甘油殘留量，應≤10g/L。（2） 紅細胞抗原穩定性檢測：用鹽水試管法檢測紅細胞的A、B抗原，和冰凍前檢測結果應一致。

1.3 冰凍亞型紅細胞使用過程的質量控制方法

1.3.1 紅細胞保存 （1）按壓積紅細胞的1.5倍加入保存液懸浮。作為本站無償獻血者和醫院供血庫ABO血型鑒定室內質控品時，用MAP紅細胞保存液作為保存介質；作為醫院供血庫質量測評、輸血技能及輸血技能培訓標本時，加入和紅細胞同時冰凍保存的原始血漿作為保存介質；用于對單克隆抗血清試劑進行質量評估和選擇時，用MAP和血漿均可作為保存介質。（2）按終濃度為0.05mg/mL的比例加入硫酸慶大霉素抑菌劑，混勻后分裝貼簽，2～6℃冰箱保存備用。

1.3.2 確定紅細胞保存效期 觀察紅細胞在保存過程中FHb和A、B抗原的變化，以紅細胞每天置室溫1h再恢復2～6℃儲存的模式下，FHb濃度達1.0g/L，同時紅細胞血型抗原減弱達1+的最小儲存天數再減10d作為其使用效期。

1.3.3 紅細胞使用 （1）每次使用前，將紅細胞置于室溫平衡15～30min，用完后立即放回2～6℃冰箱保存，每天置于室溫時間應≤1h。（2）每次使用前必須檢查紅細胞，發現溶血、顏色變化、細菌污染等，即放棄使用并更換新的紅細胞。（3）紅細胞必須在規定的有效期內使用。以MAP紅細胞保存液作為保存介質時的有效期規定為40d；以血漿作為保存介質時的有效期規定為20d。

2 結果

用上述優化選擇的試驗參數制備冰凍亞型紅細胞，紅細胞融化洗滌后上清液的FHb含量、甘油殘留量及紅細胞抗原反應性檢測結果均符合預期要求；在規定的有效期內，紅細胞性能穩定，使用效果良好。

3 討論

ABO亞型在人群中的比例約為1.50/萬[9]，遠遠低于RhD陰性在人群中0.3%～0.5%[10]的比例。所以，只有將其冰凍保存才能得到有效利用。在制備過程中，紅細胞甘油化和去甘油化是影響紅細胞質量的重要因素。甘油化是紅細胞內外環境從低滲到高滲的過程，因此，在滴加甘油時要緩慢均勻，結合一定頻率的震蕩及一定時間的平衡，使甘油充分擴散、滲透入紅細胞。計算甘油添加量時，應充分考慮細胞內水，根據紅細胞懸液重量、密度、壓積等參數進行計算，以保證甘油終濃度達到40%，從而減少冰晶對紅細胞的損傷。去甘油化和甘油化正好相反，是紅細胞內外環境從高滲到低滲的過程，因此，在加入梯度NaCl溶液時也要緩慢均勻，同時進行一定的震蕩和平衡，加快甘油從細胞內向細胞外轉移，使細胞內外的滲透壓逐漸降低到和生理鹽水的滲透壓相同，從而減少因滲透壓過快降低而導致的紅細胞損傷。如果在冰凍前去除甘油化紅細胞中多余的水分和甘油，則可節省去甘油過程中甘油從細胞內向細胞外滲出平衡的時間，從而縮短去甘油化過程，進一步減少紅細胞損傷。

洗滌去除甘油的亞型紅細胞在保存使用過程中，紅細胞的保存介質和保存溫度最為關鍵。因為紅細胞沒有細胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產生ATP的同時，也會產生乳酸和丙酮酸等代謝產物，這些產物如果在人體內可被其他組織氧化利用，而在人體外卻因得不到充分利用而使其PH下降，而PH過低時會引起ATP從紅細胞中的釋放速率加快，導致紅細胞ATP耗竭，從而使紅細胞發生裂解 [11-13]。不但使細胞內的Hb游離出細胞外，而且嚴重影響紅細胞血型抗原成分的穩定性。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細胞保存液作為保存介質，在一定時間內，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細胞提供足夠的能量，中間含有的甘露醇還具有抵抗紅細胞溶解和加固細胞膜的作用，所以能有效維持紅細胞的形態與結構，保證其使用質量和效果。同時，血液作為一種熱敏物質，對溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細胞代謝速率越快，能量消耗越多，隨著保存介質中營養物質的不斷消耗以及代謝產物的逐漸堆積，會進一步加重紅細胞的儲存損傷，繼而使紅細胞裂解死亡。所以，我們通過試驗觀察，對冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存溫度及保存時間進行了具體規定并嚴格執行，從而保證了冰凍亞型紅細胞在血型血清學試驗中的使用效果。

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（收稿日期：2014-04-28）