樹鼩肝臟疾病動物模型研究新進展

呂淑娟　唐安洲

[摘要]肝病的危害，尤其是肝炎的流行以及肝癌的高死亡率已經成為國內外共同關注的重要衛生問題之一，由于缺乏理想的動物模型，某些肝炎及肝癌目前尚未清楚其發病的生理學機制，為了尋找有效的防治方法，建立合適的動物模型顯得極其重要。樹鼩在醫學研究中的價值近年來受到越來越多的關注。國內外的研究發現，人們利用樹鼩成功建立了多種肝臟疾病的動物模型，多數研究集中在人類病毒性肝炎及肝癌方面。本文主要介紹肝臟疾病樹鼩動物模型的國內外新進展。

[關鍵詞]樹鼩；肝臟疾病；動物模型

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）17-32-04

[Abstract] Hepatopathy damage， especially the popular of hepatitis and high-mortality of liver cancer has become one of the major health issues of common concern at home and abroad， due to the lack of ideal animal model， pathophysiological mechanisms of some hepatitis and liver cancer was not yet clear， establishing an appropriate animal mode should be extremely important in order to find effective prevention methods. The value of medical research of tree shrew had been payed more and more attention in recent years. Researches found that people established a variety of animal models with liver disease successfully by using the tree shrew， most research had focused on aspects of human viral hepatitis and liver cancer. This paper described a new progress of animal model with liver disease by tree shrews.

[Key words] Tree shrews； Liver disease； Animal models

肝臟疾病是危害人類健康的重要疾病，包括病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、脂肪肝等，目前尚無理想的治療方法。甲型肝炎、乙型肝炎雖有疫苗，但不能忽視未來由于病毒變異帶來的威脅。丙型肝炎目前尚未發現非常有效的疫苗，且丙型肝炎的病理學機制也尚未完全清晰。針對肝臟疾病的研究以及藥物研發仍有賴于良好的動物模型，非人靈長類猩猩、猴等與人親緣相近，但用作動物模型具有個體大、難操作、繁殖慢、資源有限、研究周期長、費用昂貴等不足，為尋找良好的、簡便的、實用的肝臟疾病動物模型，有眾多學者把目光關注到樹鼩。

樹鼩（Tupaia belangeri）是一種生長于熱帶及亞熱帶地區的小型動物，屬靈長目、原猴亞目（狐猴亞目）、樹鼩科，也有學者認為屬靈長目與食蟲目之間的獨立階元——攀鼩目，樹鼩在生物學分類上比大、小鼠、土撥鼠等常用嚙齒目實驗動物更接近人類，新陳代謝比犬、鼠等動物更接近于人類，在我國主要分布于云南、廣西等西南部省區，具有個體小、易

操作、繁殖快、研究周期短、費用低等優點，研究表明，樹鼩能被多種與人類疾病有關的病毒感染。由于這些特點，樹鼩在醫學研究中的價值近年來受到越來越多的關注，已被應用于醫藥生物學研究的諸多領域。本文就近年來國內外有關樹鼩在人類肝臟疾病動物模型的研究進行綜述，以期為今后的深入研究及應用提供依據。

1 人類病毒性肝炎樹鼩模型

1.1 甲型肝炎樹鼩模型

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）引起的以肝臟炎癥病變為主的傳染病，主要的臨床表現為急性感染，狨猴是甲型肝炎較常用的動物模型。與狨猴比較，作為低等靈長類動物的樹鼩，具有個子小、數量多、繁殖快的優點。所以，作為甲型肝炎的動物模型，樹鼩有其獨特的優點。

詹美云等[1]對甲型肝炎病毒感染樹鼩進行了初步的研究，以9只成年樹鼩為研究對象，口服0.5%甲肝病毒陽性患者新鮮大便濾液0.5mL，感染后3～13d的動物糞便中可測出甲型肝炎抗原，排毒持續15～21d；部分樹鼩感染后15～45d出現轉氨酶升高，食欲減退；感染2～16周的樹鼩血清中可測出HAV抗體，滴度1︰40～1︰640，抗體陽轉率78%。感染樹鼩肝出現不同程度的充血、水腫、顆粒以及脂肪性變和枯否氏細胞增生等現象。通過該實驗可以初步說明，樹鼩能被人類甲型肝炎病毒感染，有可能取代狨猴、黑猩猩、紅面猴成為研究人類HAV的較為理想的動物模型。

1.2 乙型肝炎樹鼩模型

各種肝病的發生與乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）的慢性感染有著密切關系，因此，建立乙肝動物模型顯得極為重要，國內外以樹鼩為研究對象進行了不少的嘗試并取得了一定的結果。

蘇建家等[2]以53只樹鼩為研究對象，靜脈注射乙肝病毒陽性患者血清，其中發現有45只樹鼩（84.9%）的血清和肝組織出現HBV標記物，血清學、免疫組織化學、分子雜交以及電鏡檢查等技術檢測可見，在接種了人HBV的樹鼩的血清中檢測出HBsAg及Dane顆粒，肝細胞中也檢測出HBsAg，HBeAg及HBV-DNA，以上結果均可表明樹鼩可以感染人HBV，有望成為乙肝動物模型。Wang等[3]將不同乙肝患者血清單一或混合地接種于77只1～3日齡幼兒樹鼩和49只2周～1歲成人樹鼩，利用血清學、免疫組化、酶聯免疫吸附測定法、分子雜交以及電鏡檢查等技術檢測HBV標志物，新生兒組中有6只（7.8%）被確診為乙肝病毒感染超過72周，7只持續性感染，而成人組幾乎無持續性感染，證實新生兒樹鼩較成人樹鼩易感人HBV。Yan等[4]不僅證實樹鼩可以感染人HBV， 同時利用Southern blot法檢測出HBV-DNA復制中間體，提示HBV能在樹鼩連續傳代感染。Walter等[5] 以人HBV作用于樹鼩原代肝臟細胞，在細胞上清液中檢測出HBsAg。用人陽性乙肝病毒接種樹鼩，接種2～3周后可在樹鼩血清中檢測到逐漸增多的表面抗體和E抗體，說明樹鼩的確對人HBV易感。王學軍[6]通過肝臟原位兩步灌注法分離PTH并對其凍存方法進行優化，通過共轉染293T細胞生產基于慢病毒包裝系統的乙型肝炎病毒假病毒并考察其感染的種屬和組織特異性，包裝的乙型肝炎病毒假病毒具有與HBV真病毒類似的感染種屬和組織特異性，該模型的建立對深化HBV進入肝細胞機制的研究具有重要意義。endprint

1.3 丙型肝炎樹鼩模型

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染容易導致肝硬化，嚴重者可發生肝癌。未來與HCV感染相關的死亡率將繼續增加，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛生問題。近年來，國內外對樹鼩是否能夠感染人的HCV做了很多嘗試，并取得一定的成果。

付喜花等[7-8]研究發現樹鼩可以感染人HCV。閔峰[9]以樹鼩為研究對象，分離出肝細胞，并用HCV RNA陽性血清直接作用于原代培養的肝細胞，利用RT-PCR法檢測細胞內或培養上清，發現在感染后3～5d，細胞內可檢出HCV正負鏈RNA。免疫組織化學結果顯示，細胞內有HCVNS3、NS5特異性抗原表達。證實了HCV在體外確實能感染原代培養的樹鼩肝細胞，并在其細胞內進行復制。趙西平等[10] 將HCV RNA 陽性血清加入原代樹鼩肝細胞進行培養，并用感染后細胞培養上清液加入新制備的肝細胞中進行傳代感染，利用RT-PCR技術檢測被感染肝細胞正、負鏈HCV RNA以及培養上清液中包裝后HCV RNA，同時對感染前后病毒準種變化進行分析，結果在細胞培養上清液中檢出HCV RNA，提示樹鼩肝細胞體外可支持HCV復制。Xu等[11]以樹鼩為研究對象，對其分別接種4種HCV基因型（1b，2c，3b和6） 的人血清和HCV轉染細胞的培養上清液。接種前后測定丙氨酸氨基轉移酶（ALT），HCV RNA水平和動物病毒載量。結果顯示只要接種單一基因型的HCV含量足夠高，同時在非免疫抑制狀態下成年樹鼩即可有效感染人HCV或轉染細胞的培養上清中HCV。Tong等[12]報道CD81，SR-BI，Claudin-1和OCLN等分子可介導HCV感染樹鼩肝細胞。Tian等[13] 對樹鼩肝細胞CD81與HCV包膜上的糖蛋白E2的相互作用進行研究發現， 由于樹鼩CD81 LEL中的第六號氨基酸殘基與人類不同，發生了改變，使得樹鼩CD81與HCVE2的相互作用明顯的降低了。

1.4 丁型肝炎樹鼩模型

丁型病毒性肝炎是由丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus，HDV）與乙肝病毒等嗜肝DNA病毒共同引起的傳染病。丁肝病毒要依賴于乙肝等DNA病毒的輔助才能進行復制，因此易造成 HDV與HBV的重疊感染，重疊感染后可加重肝損害，且極易發展為慢性活動性肝炎、肝硬化和重型肝炎危害人類生命。丁肝病毒感染模型的建立必須以乙肝感染為基礎進行研究。

吳煒強等[14]以樹鼩為研究對象，接種HDV/ HBV陽性血清后1周，利用免疫組化技術，檢測樹鼩肝組織中的HDAg，HBsAg，同時采用原位雜交方法對部分樹鼩肝內HDV RNA進行檢側。結果顯示HDAg在肝內主要定位于肝細胞；部分實驗樹鼩肝組織細胞漿或細胞核HDV RNA顯陽性。提示樹鼩可被人HDV感染，成為丁型肝炎研究的動物模型。Li等[15]以HDV/HBV陽性血清感染樹鼩，研究丁型肝炎發病的機制，為藥物篩選提供了基礎。在感染HBV的基礎上，將人HDV和HBV陽性血清以同時感染和重疊感染兩種方式接種于成年樹鼩，進行了HDV感染的研究。實驗還進一步證實了人工傳代感染HDV可在樹鼩間實現。肝組織病理學觀察可見，將HDV感染樹鼩后，引起肝臟類似肝炎的病理變化，不同的病理類型均可呈現，但較易形成慢性發病過程。HBsAg、HDAg和抗-HD陽性可在大部分樹鼩血清中檢測出。以上結果均提示樹鼩可作為慢性HDV感染的動物模型。

1.5 戊型肝炎樹鼩模型

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起，如今已成為世界廣泛關注的公共衛生問題。該病較多發生在在非洲、拉丁美洲和亞洲中許多衛生條件較差的發展中國家，但在日本、英國、美國等發達國家也有流行，患病人數竟達近百萬人[16]。

蔣雷等[17]從豬群中分離、鑒定HEV，經靜脈注射途徑感染樹鼩，采集糞便、血液以及器官組織，應用巢式RT-PCR檢測樹鼩感染情況，觀察感染后樹鼩各器官組織病理學變化。結果發現，感染7d后血液、糞便、肝臟、小腸等樣品可檢測出 HEV RNA，病毒血癥持續約2周。組織病理學觀察結果，人工感染HEV的樹鼩肝臟可見靜脈竇淤血、多發性淋巴細胞浸潤、庫普弗細胞增多等病變。研究結果表明樹鼩對HEV具有易感性，感染后肝臟出現病毒性肝炎的病理學變化。

2 肝癌樹鼩模型

肝癌是全球常見的癌癥。近年來，在樹鼩是否可作為肝癌動物模型方面，國內外的研究工作者作過十分有益的嘗試，同時取得了相當不錯的成果。Yan等[18]以成功建立樹鼩感染人類HBV動物模型為基礎，研究HBV和黃曲霉毒素B1（AFB 1）在肝腫瘤形成中的作用。結果表明，同時感染HBV和暴露于AFB 1中的肝癌發生率（52.94%）明顯高于單純感染HBV（11.11%）或單純暴露于AFB 1中（12.50%）首次在動物體內證實AFB1和HBV在HCC形成過程中有協同作用。陳曉燕[19]應用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解吸飛行時間串聯質譜法對同一動物自身的癌發生前、后的肝癌組織及未經AFB1處理的對照組動物肝組織進行了相互比較。探討AFB1與HBV同時作用樹鼩誘發肝癌生長不同階段的蛋白質表達譜的改變，篩查出在這兩個因素共同誘發的肝癌發生發展中起重要作用的關鍵蛋白質分子。實驗結果發現在AFB1與HBV共同誘發的樹鼩肝癌發生發展不同階段存在明顯的差異性蛋白表達譜。秦雪[20]對AFB1誘發的樹鼩肝癌發展不同階段的蛋白質表達譜的改變進行比較，篩選出在AFB1 誘發的肝癌發生發展中起關鍵作用的蛋白質分子。發現在AFB1誘發的樹鼩肝癌發生發展的不同階段存在明顯的差異性蛋白表達譜。為找出肝癌關鍵蛋白、闡釋肝癌發生機制提供實驗基礎。岳惠芬等[21]通過構建帶HBx的pcDNA3.1的真核表達基因的載體，以脂質體2000包被之。以微量注射器將此復合物注入雄性樹鼩睪丸曲細精管組織中。探討以精原干細胞介導X基因的轉移，建立帶HBx基因的樹鼩轉基因動物模型。發現能成功建立帶HBx基因的樹鼩轉基因動物模型，這一成果將有助于HBV生活周期中各個環節的研究，為HBV 的感染、肝細胞癌變的發生等致病機制的研究提供依據。使得進一步研究繼續傳代產生HBx基因在肝細胞表達的樹鼩動物模型提供可能。Yue等[22]??通過AFB1誘發6只樹鼩產生肝癌，評估過氧化物酶Ⅱ（PrxⅡ）的mRNA和蛋白表達在肝細胞癌發生過程中的作用及其意義。結果表明PrxⅡ可能在肝癌發生中發揮重要作用，并可能被用來作為肝癌??的預防和治療的分子靶標。Li等[23]以樹鼩為研究對象，在AFB1誘發樹鼩肝癌的基礎上，采用cDNA微陣列技術，對肝癌發生過程中的基因表達進行動態的分析。歸類觀察到的基因，篩選目的基因的和分析差異表達基因，為探明肝癌發生的機制提供依據。Li等[24]以上述研究為基礎，采用RT-PCR和Western blot技術，對過氧化物酶PrxII在樹鼩肝癌組織中過表達進行更深入的研究，發現過氧化物酶PrxII將在肝癌的發生發展過程中發揮著重要的作用。endprint

3 展望

綜上所述，人們利用樹鼩建立了多種肝臟疾病的動物模型，多數研究集中在人類病毒性肝炎及肝癌方面，肝硬化方面偏少，一般而言，肝炎 、肝硬化、肝癌間有著非常密切的關系，一般我們較常見的肝硬化大多數都是從乙型肝炎發展而來，而肝硬化當中，有的經過時間的演變則可發展成肝癌，因而樹鼩肝硬化模型值得探索。此外，多數研究多采用樹鼩整體進行研究，采用樹鼩肝細胞作為體外模型的偏少，因而樹鼩肝細胞模型同樣值得探索，這也會進一步為肝臟疾病發病機制的研究和治療藥物的篩選提供平臺。

近年來，樹鼩作為一種新型實驗動物，正日益受到國內外的關注。樹鼩實驗動物化方面的研究在一些國家已經正式開展，同時取得了不錯的成果。在我國，昆明醫學院經過多年的努力，在2010年10月完成了“實驗樹鼩云南省地方標準”的研究和編制工作，使得我國實驗樹鼩標準化成為可能。另外，廣西醫科大學也在進行廣西野生樹鼩實驗動物化的探索。在現有的研究基礎上，我們可以想象得到樹鼩實驗動物化后將在醫學實驗研究領域發揮著怎樣重要的作用。基于樹鼩的獨特性，用作疾病模型不僅是在肝病研究，還是在其他疾病的研究方面也將具有廣闊的應用前景。

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（收稿日期：2014-07-09）endprint