酶聯(lián)免疫法與間接血凝法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔弓形蟲(chóng)抗體的結(jié)果比較

潘嚴(yán)　李彩云　陳嘯天等

[摘要] 目的 分析比較酶聯(lián)免疫法（ELISA）和間接血凝法（IHA）在本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用家兔弓形蟲(chóng)特異性抗體的可行性。 方法 應(yīng)用ELISA和IHA兩種方法平行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染弓形蟲(chóng)的12只家兔陽(yáng)性血清和未感染過(guò)弓形蟲(chóng)的30只正常家兔陰性血清中的弓形蟲(chóng)特異性抗體。比較兩種方法敏感性、特異性、檢測(cè)效率及Youden指數(shù)并運(yùn)用kappa值進(jìn)行一致性的評(píng)價(jià)。 結(jié)果 IHA法的敏感性41.67%，特異性93.33%，ELISA法的敏感性100%，特異性100%。ELISA方法的敏感性、特異性、檢測(cè)效率及Youden指數(shù)都在IHA方法之上。兩種方法的總符合率是78.57%。kappa值=0.3998。 結(jié)論 ELISA法與IHA法在本次平行檢測(cè)中的一致性較差。ELISA方法敏感性、特異性明顯優(yōu)于IHA方法，更適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔的弓形蟲(chóng)特異性抗體的檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 弓形蟲(chóng)，抗體；酶聯(lián)免疫試驗(yàn)；間接血凝試驗(yàn)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）17-113-05

[Abstract] Objective To analyze and compare the feasibility of using ELISA and IHA in our laboratory for testing specific TOX-Ab in laboratory rabbit. Methods Used ELISA and IHA methods for a parallelized testing of the specific TOX-Ab contained in both the positive serum of 12 rabbits infected with toxoplasma gondii and negative serum of 30 uninfected rabbits， thus to compare the sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index between the two methods before applying Kappa values for a consistency evaluation. Results The sensibility and specificity of IHA was 41.67% and 93.33% respectively， while that for ELISA are both 100%. The sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index for ELISA are higher than that of IHA. The total consistency rate for such two methods was 78.57% with Kappa value equals to 0.3998. Conclusion The consistency between the use of ELISA and IHA for this parallelized testing is relatively poor， and ELISA is notably better than IHA in terms of sensitivity and specificity， therefore it is more suitable to be applied in the testing of the specific TOX-Ab in laboratory animal-rabbit.

[Key words] Toxoplasma gondii； Antibody； ELISA； IHA

剛地弓形蟲(chóng)簡(jiǎn)稱(chēng)弓形蟲(chóng)是寄生于貓科動(dòng)物的腸道寄生蟲(chóng)，寄生于人體腦、眼、肺、心臟、淋巴結(jié)等組織引起寄生蟲(chóng)病。該蟲(chóng)是一種重要的機(jī)會(huì)致病原蟲(chóng)，尤其在宿主免疫功能低下時(shí)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。弓形蟲(chóng)呈世界性分布，西方發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)感染率較高，在美國(guó)所有肉食品中豬肉被認(rèn)為是人類(lèi)弓形蟲(chóng)病的最大肉食性來(lái)源。據(jù)國(guó)外報(bào)道，人群的平均感染率是25%～50%，有人推算全世界約有至少5億人感染弓形蟲(chóng)[1-2]。自從1957年我國(guó)于恩庶第一個(gè)成功地從貓和兔子體內(nèi)分離到弓形蟲(chóng)病原體開(kāi)始，逐步發(fā)現(xiàn)我國(guó)人群感染弓形蟲(chóng)病原體較為廣泛。人和許多動(dòng)物都能感染，引起人畜共患的弓形蟲(chóng)病[3]。弓形蟲(chóng)檢測(cè)方法有很多，比較常用的有病原學(xué)檢查方法如動(dòng)物接種法，直接染色鏡檢法。分子生物學(xué)診斷方法如PCR技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)（主要是DNA探針技術(shù)）、單克隆抗體技術(shù)以及基因芯片技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染，基因芯片技術(shù)更具有靈敏、特異、早期診斷的意義，但由于基因診斷技術(shù)的高度的敏感性，操作不當(dāng)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。

迄今最常用的是檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的血清學(xué)方法。1994年的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲(chóng)檢測(cè)國(guó)標(biāo)上規(guī)定間接血凝方法（IHA）是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)抗體的兩種主要的方法之一（另一種方法是IFA方法），但該方法操作耗時(shí)，結(jié)果判斷容易受主觀因素影響。酶聯(lián)免疫法（ELISA）是很多學(xué)者公認(rèn)的檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的一種可重復(fù)的方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果判斷客觀等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用人弓形蟲(chóng)病的免疫學(xué)診斷[4]。并且2008年重新修訂的國(guó)標(biāo)上已新增ELISA方法為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)抗體的檢測(cè)方法。研究表明[5]，對(duì)ELISA和其他一些血清學(xué)方法診斷弓形蟲(chóng)病進(jìn)行評(píng)價(jià)，認(rèn)為該法是檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的一種可重復(fù)的方法，易自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。目前，臨床上多采用同時(shí)檢測(cè)IgM、IgG的方法來(lái)診斷現(xiàn)癥感染。近幾年主張采用兩種或多種方法結(jié)合提高診斷的準(zhǔn)確率，可以將IHA與ELISA或IFA同用，以提高的檢出率和準(zhǔn)確度[6]。新的弓形蟲(chóng)病的診斷方法主要在于提高敏感性和特異性，以及使操作更為簡(jiǎn)便快捷。本研究運(yùn)用ELISA和IHA方法對(duì)同一批家兔血清進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)這兩種定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法的結(jié)果作比較分析。

1 材料與方法

1.1 陽(yáng)性血清

由上海市疾控中心提供12只實(shí)驗(yàn)感染弓形蟲(chóng)速殖子的家兔血清并用染色方法（DT）檢測(cè)確診的陽(yáng)性標(biāo)本。

1.2 陰性血清

本實(shí)驗(yàn)室提供已用染色方法（DT）檢測(cè)確診陰性的健康家兔血清標(biāo)本。

1.3 試劑

動(dòng)物用弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）從珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司購(gòu)得。其中主要成分及批號(hào)為：（1）酶標(biāo)記物，20131106；（2）濃縮洗滌液，770131114；（3）顯色液A，720130916；（4）顯色液B，730131105；（5）樣品稀釋液，720130916；760130905；（6）終止液，740131104；（7）陽(yáng)性對(duì)照，20131106；陰性對(duì)照，20131106，臨界對(duì)照，20131106。弓形蟲(chóng)抗體間接血凝試驗(yàn)試劑盒，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，批號(hào)：20131205。

1.4 儀器設(shè)備

SPECTRAmax340pc酶標(biāo)儀，Thermo（815）恒溫培養(yǎng)箱，各種刻度的微量移液器，96（12×8）孔1100 V形有機(jī)玻璃板，微型震蕩器等。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 IHA試驗(yàn)操作步驟 （1）配制診斷液：弓形蟲(chóng)IHA診斷試劑按瓶上標(biāo)示毫升數(shù)加滅菌蒸餾水稀釋搖勻，2000r/min離心10min棄上清液，加等量的稀釋液搖勻，置4℃下靜置24h后使用。（2）加稀釋液：用微量移液器在96孔有機(jī)玻璃反應(yīng)板的每孔加75μL，每個(gè)樣品需加稀釋液3孔，均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清、空白對(duì)照。陰、陽(yáng)性對(duì)照加8孔（其中第8孔為稀釋液對(duì)照）。（3）加待測(cè)血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清：第1孔加相應(yīng)血清25μL。（4）稀釋?zhuān)憾ㄐ詸z測(cè)稀釋到第3孔，對(duì)照血清稀釋到第7孔，定性檢測(cè)的第4孔、對(duì)照血清的第8孔為稀釋液對(duì)照。（5）加診斷液：將診斷液搖勻，每孔加25μL診斷液，加完后將反應(yīng)板置微量振蕩器上振蕩1～2min，取下反應(yīng)板，蓋上一塊與反應(yīng)板大小相近的玻璃置37℃作用2～3h后觀察結(jié)果。（6）結(jié)果判定方法：在陽(yáng)性對(duì)照血清效價(jià)不低于1∶1024，陰性對(duì)照血清除第1孔允許有前滯現(xiàn)象“+”外，其余各孔均為“-”稀釋液對(duì)照為“-”的前提下，待檢血清效價(jià)達(dá)到或超過(guò)1∶64為陽(yáng)性。“++”為陽(yáng)性終點(diǎn)。

1.5.2 ELISA試驗(yàn)操作步驟 （1）洗滌液配制：試劑盒放置室溫平衡20～30min。濃縮洗滌液用去離子水10倍稀釋。（2）樣品稀釋?zhuān)簶悠?∶100稀釋?zhuān)簩悠废♂屢?mL加入一潔凈小管內(nèi)，加10μL待檢樣品，充分混勻。（3）加樣反應(yīng)：加板條固定于板架上，剩余的板條用不干膠密封并放入密封袋中保存。每孔加入稀釋后樣品100μL。臨界對(duì)照加3孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各加1孔，100μL/孔。另留一孔不加任何液體為空白對(duì)照。置37℃30min。（4）加酶反應(yīng)：甩凈孔中液體，洗板3次，每次停留1min后甩凈拍干，除空白對(duì)照外每孔加酶標(biāo)記物1滴，置37℃30min。（5）顯色反應(yīng)：甩凈孔中液體，同上洗板3次，拍干后各孔滴加顯色液A、B各1滴，置37℃避光10min。（6）終止反應(yīng)：每孔立即加入終止液1滴，混勻后用酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)判定結(jié)果。（7）結(jié)果判定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。陰性對(duì)照值≤0.20，臨界對(duì)照OD值0.20～0.60，陽(yáng)性對(duì)照值>0.60，證明實(shí)驗(yàn)成立。按以下方法判斷：陽(yáng)性：樣品OD值>臨界對(duì)照OD值平均值×1.1；可疑：臨界對(duì)照OD值平均值×0.9≤樣品OD值≤臨界對(duì)照OD值平均值×1.1；陰性：樣品OD值<臨界對(duì)照OD值平均值×0.9。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS16.0進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IHA檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用IHA方法檢測(cè)已知兔陽(yáng)性血清1～12號(hào)樣本中，3#、5#、8#、9#、11#5個(gè)樣本紅細(xì)胞部分呈膜狀沉著，周?chē)心瘓F(tuán)點(diǎn)，中央沉點(diǎn)大。血清效價(jià)≥1∶64判定為“++”，其余7個(gè)樣本紅細(xì)胞沉集于中心，周?chē)鸁o(wú)沉著物，分界清楚。血清效價(jià)<1∶64均呈陰性反應(yīng)。

應(yīng)用IHA方法檢測(cè)已知兔陰性血清1～30號(hào)樣本中，除了16#、22# 2個(gè)樣本血清效價(jià)≥1∶64判定為“++”，其余28個(gè)樣本均呈陰性反應(yīng)。

根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果得出IHA方法檢測(cè)已知兔陽(yáng)性血清的敏感性是41.67%，檢測(cè)已知兔陰性血清特異性是93.33%。見(jiàn)表1。

3 討論

自從上個(gè)世紀(jì)60年代于恩庶等在國(guó)內(nèi)首先建立DT染色試驗(yàn)用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染以來(lái)，現(xiàn)有的弓形蟲(chóng)感染的血清學(xué)診斷技術(shù)不下10余種。雖然DT試驗(yàn)特異強(qiáng)，敏感性高已被公認(rèn)，但是DT染色試驗(yàn)需要弓形蟲(chóng)活的蟲(chóng)體，在實(shí)際應(yīng)用中不易開(kāi)展。因此現(xiàn)在國(guó)內(nèi)已不再有人用此方法來(lái)檢驗(yàn)弓形蟲(chóng)感染。目前主要用抗體檢測(cè)法，如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CT），間接血凝試驗(yàn)（IHA），乳膠凝集試驗(yàn)（LAT），碳粒凝集試驗(yàn)（CAT），間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。應(yīng)用較多的是IHA、ELISA和IFA。IHA有商品抗原供應(yīng)，操作方法簡(jiǎn)便，所以應(yīng)用較廣。ELISA敏感性特異性?xún)?yōu)于IHA。間接血凝試驗(yàn)（IHA）其原理是抗原包被于紅細(xì)胞表面成為載體再與相應(yīng)的抗體結(jié)合，從而使紅細(xì)胞聚集在一起，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。但容易發(fā)生非特異性凝集現(xiàn)象。Jacob和Lunde1957年首次將間接血凝實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)病[8]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體。將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，與受檢血清中特異性的抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶，催化底物3，3—5，5—四甲基聯(lián)苯胺顯色，3，3—5，5—四甲基聯(lián)苯胺顯色，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取OD值，判定有無(wú)弓形蟲(chóng)特異性抗體，結(jié)果較為客觀。而IHA方法僅依靠肉眼識(shí)別凝集顆粒的有無(wú)以及大小，主觀因素的影響不可忽視。此外，實(shí)驗(yàn)室之間，不同批號(hào)制備的致敏紅細(xì)胞的質(zhì)量大相徑庭，重復(fù)性較差，這些缺點(diǎn)客觀上不利于IHA方法的廣泛使用。然而，IHA方法簡(jiǎn)便快速，所用器材簡(jiǎn)單，便于大批量樣品基層單位使用。ELISA方法的操作簡(jiǎn)便快捷，但對(duì)操作和時(shí)間的要求比較嚴(yán)格。另外，ELISA是診斷弓形蟲(chóng)感染應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，ELISA試劑盒的最明顯的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)計(jì)的親和力[9]。

當(dāng)前ELISA方法在檢測(cè)弓形蟲(chóng)病原診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。國(guó)外不少實(shí)驗(yàn)室也有用重組抗原診斷弓形蟲(chóng)病。如Lecordier等用重組的致密顆粒抗原（Dense granule antigen，GRA）GRA1和GRA6作為診斷用抗原取得良好的結(jié)果[10]。國(guó)內(nèi)賈雪梅等也建立了GRA1基因體外擴(kuò)增方法，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GRA1與GRA6-Nt聯(lián)合應(yīng)用可使敏感性達(dá)到98%。GST-GRA6-Nt與GAR1聯(lián)合采用ELISA法可于弓形蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷[10]。親和素-生物素-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ABC-ELISA）國(guó)內(nèi)外資料顯示，其敏感性比ELISA法高出3～8倍，開(kāi)拓了ELISA在弓形蟲(chóng)微量抗原/抗體的檢測(cè)方面的新路。其原理是通過(guò)親和素對(duì)生物的高度親和力與導(dǎo)入生物素的酶分子緊密結(jié)合，能產(chǎn)生放大作用。另外，斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA），雙夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（DS-ELISA），抗體抗體親合度（Avidity）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等這些新型改良后的ELISA方法使顯色更為清晰，能減少假陽(yáng)性率的發(fā)生。抗體抗體親合度（Avidity）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)最早由Hedman等使用，這種方法可以確認(rèn)4、5個(gè)月前的感染，對(duì)于檢測(cè)懷孕動(dòng)物最初期的抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM陽(yáng)性非常有用。ELISA和免疫印跡實(shí)驗(yàn)（IBT）方法目前主要用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)的特異循環(huán)抗原或抗體，廣泛用于現(xiàn)癥感染。國(guó)內(nèi)周永安等認(rèn)為這兩種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在人和動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的診斷方面?zhèn)鹘y(tǒng)診斷應(yīng)與其他新的診斷技術(shù)取長(zhǎng)補(bǔ)短，相互補(bǔ)充才能在弓形蟲(chóng)病的診斷中發(fā)揮其應(yīng)有的主要作用[11]。

本研究應(yīng)用ELISA和IHA兩種方法，平行檢測(cè)12只弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性兔血清和30只弓形蟲(chóng)IgG抗體陰性兔血清。結(jié)果提示本次實(shí)驗(yàn)中兩種方法陽(yáng)性符合率是41.67%，陰性符合率93.33%。總符合率78.57%。ELISA方法的敏感性特異性均在IHA方法之上。呂元聰?shù)炔捎猛慌鍖?duì)IHA、IFA、ELISA三種血清學(xué)方法診斷弓形蟲(chóng)病進(jìn)行了比較研究，結(jié)果IHA、IFA、ELISA檢出的陽(yáng)性率分別為6.9%、8.5%、15.4%。以ELISA法最為敏感。然后再用ELISA與IHA法進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)在同一條件下分別進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和交叉實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示ELISA法有良好的特異性[12]，與本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。然而本次實(shí)驗(yàn)中兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性較差（kappa值=0.3998），出現(xiàn)這種結(jié)果可能與兩種方法的試劑盒原理、操作步驟、和結(jié)果判定等因素存在著差異相關(guān)。ELISA方法的敏感性和特異性、檢測(cè)效率、Youden指數(shù)均高于IHA方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室采用兩種方法平行檢測(cè)家兔弓形蟲(chóng)抗體的結(jié)果表明，雖然ELISA方法和IHA方法均可用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔的弓形蟲(chóng)抗體，但前者敏感性、特異性、檢測(cè)效率及Youden指數(shù)均優(yōu)于后者，更適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔的弓形蟲(chóng)特異性抗體的檢測(cè)。

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（收稿日期：2014-06-27）