UPLC—MS/MS法快速檢測減肥類保健食品中5種非法添加化學(xué)成分

郝剛　顧炳仁

[摘要]目的 建立專屬、靈敏的UPLC-MS/MS方法用于快速定性定量檢測減肥類保健食品中5種非法添加化學(xué)成分。 方法 供試樣品經(jīng)甲醇提取后，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），以BEH-C18為分析柱，流動(dòng)相采用含0.1%冰醋酸的20mmol/L醋酸銨水溶液和甲醇進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧電離（ESI）、多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式，對(duì)保健食品中非法添加的鹽酸西布曲明、酚酞、鹽酸芬氟拉明、咖啡因、呋塞米等5種化學(xué)成分進(jìn)行快速定性定量檢測。 結(jié)果 所建立方法能快速定性定量檢測保健食品中5種非法添加化學(xué)藥物成分，5種成分在6min內(nèi)完全分離，且線性良好，平均加樣回收率在97.7%～100.7%，方法檢出限為0.0025～0.0075mg/g。 結(jié)論 所建方法快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，適用于減肥類保健食品中非法添加化學(xué)成分的快速定性定量檢測。

[關(guān)鍵詞] UPLC-MS/MS；MRM；非法添加

[中圖分類號(hào)] TS218 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）17-106-05

[Abstract] Objective The study aimed to develop a specific， sensitive and rapid UPLC-MS/MS method to identify 5 illegal additives in slimming health food. Methods The ultra performance liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry method was used to detect the samples extracted by methanol. The separation was performed on Waters UPLC using BEH-C18 column with a gradient elution. The mobile phase was consisted of 20mmol/L ammonium acetate （containing 0.1% acetic acid） and methanol. Qualitative and quantitative analysis of caffeine， furosemide， fenfluramine， phenolphthalein and sibutramine was conducted in the MRM mode by UPLC-MS/MS. Results A good resolution of 5 chemical drugs within 6 min was obtained by UPLC-MS/MS. The calibration curves showed good linear relationship in the range of 1-200ng/mL for each component. The determination limits was at 0.0025-0.0075mg/g， and the average recovery rate was 97.7%-100.7%. Conclusion The method was proved to be specific， rapid and sensitive， which was able to be used to identify 5 illegal additives in weight reducing health food.

[Key words] UPLC-MS/MS； MRM； Illegal additives

近年來，隨著我國減肥中成藥和保健食品等健康產(chǎn)品市場銷售不斷增加，一些企業(yè)為增強(qiáng)減肥效果，在產(chǎn)品中添加肥胖癥的治療藥物（如西布曲明、酚酞等），這些化學(xué)成分的毒副作用與禁忌證給消費(fèi)者造成了極大危害。在減肥類保健食品檢測中，國家食品藥品監(jiān)督管理總局保健食品風(fēng)險(xiǎn)檢測有關(guān)檢測目錄和檢測方法（編號(hào)2010114）規(guī)定了鹽酸西布曲明、咖啡因、呋塞米、酚酞、鹽酸芬氟拉明等5種違法添加化學(xué)成分的檢驗(yàn)方法，但該方法所需時(shí)間長（50min），且不能進(jìn)行定量研究[1]。本實(shí)驗(yàn)基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描方式，建立了同時(shí)定性、定量檢測鹽酸西布曲明、酚酞、鹽酸芬氟拉明、咖啡因、呋塞米等5種非法添加化學(xué)成分的分析方法，為減肥類保健食品安全監(jiān)控提供可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司）；電噴霧離子源（ESI），Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Waters）；Thermo 低溫離心機(jī)；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器；MILLIPORE純水儀。

1.2 樣品與試劑

鹽酸西布曲明對(duì)照品（批號(hào)200401，含量100.0%）、酚酞對(duì)照品（批號(hào)199601，含量100.0%）、鹽酸芬氟拉明對(duì)照品（批號(hào)200002，含量100.0%）、呋塞米對(duì)照品（批號(hào)201102，含量99.7%）、咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)1215-0104，含量100.0%）均購于中國食品藥品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為色譜純。

實(shí)驗(yàn)所用樣品均為蘇州市食品藥品監(jiān)督管理局抽樣樣品。

1.3 UPLC色譜條件

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓3.0kV；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣體流量：600L/h；錐孔氣流量：150L/h；碰撞氣體為氬氣；多反應(yīng)檢測模式（MRM）監(jiān)測。

1.5 對(duì)照品溶液

精密稱取鹽酸西布曲明、鹽酸芬氟拉明、咖啡因、酚酞、呋塞米對(duì)照品各10mg，分別置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，作為5種對(duì)照品儲(chǔ)備液（10μg/mL）。

1.6 樣品制備

樣品研細(xì)后，取細(xì)粉1.0g置于50mL容量瓶中，加甲醇約20mL，超聲15min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，13 000rpm離心10min，取上清液稀釋500倍，13 000rpm離心10min，0.22μm濾膜過濾，取上清液1μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將5種對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成500ng/mL的對(duì)照溶液，選用ESI離子化模式，通過直接進(jìn)樣法，進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。首先，采用一級(jí)質(zhì)譜掃描方式得到各化合物準(zhǔn)分子離子峰，在確定準(zhǔn)分子離子的基礎(chǔ)上，進(jìn)行錐孔電壓的優(yōu)化，得到各化合物的最佳錐孔電壓。再通過Daughter Scan掃描模式，對(duì)各種化合物的分子離子進(jìn)行二級(jí)碎片離子掃描，每種化合物選擇2個(gè)特征碎片離子作為檢測離子，用于化合物定性判斷的依據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。各化合物的分子離子及特征碎片離子分別為：咖啡因（m/z）：195>138，110；呋塞米（m/z）：329>285，205；芬氟拉明（m/z）：232>187，159；酚酞（m/z）：319>225，197；西布曲明（m/z）：280>125，139。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.3項(xiàng)下的50ng/mL濃度的對(duì)照品溶液6份，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，5種化合物峰面積的RSD分別為： 西布曲明0.50 %， 酚酞0.44 %，呋塞米0.42 %，咖啡因2.87 %，芬氟拉明1.18 %，表明儀器精密度良好。

2.6 加樣回收率

分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液8、10、12mL各3份，共9份，分別置于50mL量瓶中，每個(gè)量瓶精密加入經(jīng)測定不含上述五種化合物的減肥類保健品試樣處理液20mL，超聲15min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，13 000rpm離心10min，取上清液1μL進(jìn)樣，記錄圖譜，代入回歸方程，計(jì)算回收率，5種化學(xué)成分的平均加樣回收率分別為：咖啡因（97.7±2.5）%，呋塞米（98.9±1.7）%，芬氟拉明（99.1±2.2）%，酚酞（98.3±1.5）%，西布曲明（100.7±1.9）%。

2.7 樣品測定結(jié)果

按1.6項(xiàng)下對(duì)10批減肥類保健食品進(jìn)行樣品前處理，以所建質(zhì)譜方法對(duì)10批樣品進(jìn)行定性、定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與咖啡因、芬氟拉明、酚酞、西布曲明保留時(shí)間一致的總離子流圖，其中咖啡因檢出4批（其中2批樣品為“左旋肉堿減肥咖啡”，其咖啡因成分不做定量分析），芬氟拉明檢出2批，酚酞檢出10批，西布曲明檢出6批。采用MRM方式，利用所選定量離子對(duì)上述樣品進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表4所示，咖啡因添加量為0.88～2.31mg/g，芬氟拉明添加量為0.09～2.01mg/g，酚酞添加量為0.10～20.41mg/g，西布曲明添加量為0.08～16.3mg/g。10批供試樣品中均未檢出呋塞米。

3 討論

非法添加化學(xué)成分現(xiàn)象的日益嚴(yán)重，不僅影響了我國保健食品行業(yè)的健康發(fā)展，也給廣大消費(fèi)人群造成了極大危害。目前，國內(nèi)減肥類保健食品具有品種繁多、銷售量大、需求廣泛等特征，其常見的非法添加化學(xué)成分主要包括西布曲明、酚酞、咖啡因等物質(zhì)。這些違禁藥物嚴(yán)重威脅了服用者的生命健康，如西布曲明是抑制中樞神經(jīng)的化學(xué)藥物，服用后通過抑制食欲來達(dá)到減肥的效果，但易誘發(fā)心梗、卒中、心臟驟停等嚴(yán)重心血管疾患。而長期或過量服用酚酞，可造成人體電解質(zhì)紊亂，誘發(fā)心律失常、神志不清，甚至致癌。此外，咖啡因是一種神經(jīng)興奮劑，長期使用可能會(huì)導(dǎo)致頭痛、失眠、神經(jīng)質(zhì)、顫栗、坐立不安或心跳加速等不良反應(yīng)[2-7]。這些違禁藥物的添加具有添加量少，添加種類多等特點(diǎn)，因此，開發(fā)靈敏度高、專屬性強(qiáng)的分析方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的上述減肥類保健食品中非法添加藥物的檢測方法主要包括紫外分光光度法[8-9]，間接碘量法[10]，高效液相色譜法[11-12]，液質(zhì)聯(lián)用法[13-14]等。本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS的超高分辨能力、超高分析速度，及質(zhì)譜提供的結(jié)構(gòu)信息，開發(fā)了同時(shí)定性、定量檢測鹽酸西布曲明、鹽酸芬氟拉明、咖啡因、酚酞、呋塞米等5種減肥類保健食品中常見非法添加化學(xué)藥物的檢測方法。通過MRM掃描模式，針對(duì)每個(gè)化合物選取兩個(gè)特征碎片離子作為定性依據(jù)，同時(shí)選擇其中響應(yīng)較高的反應(yīng)離子對(duì)作為定量離子對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)上述5種化學(xué)添加藥物的同時(shí)定性定量分析，并將上述方法應(yīng)用于10批減肥類保健食品的非法添加檢測工作，結(jié)果表明，抽取的10批減肥類保健食品均添加了酚酞，而西布曲明、芬氟拉明、咖啡因等成分也有檢出，且10批固體類保健食品的非法添加量為 “mg/g”數(shù)量級(jí)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)所建方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析時(shí)間短、能同時(shí)進(jìn)行定性、定量分析等優(yōu)點(diǎn)，改進(jìn)了現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，提高了減肥類保健食品非法添加的檢驗(yàn)效率，為該類保健食品的安全監(jiān)控提供了可靠的技術(shù)保障。

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（收稿日期：2014-05-20）