氧化苦參堿對小鼠皮膚創面愈合過程中Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

鄭萍，劉彥紅，買淑霞，姚婉霞，李娟，戴貴東

(1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.凱里學院 化學與材料工程學院，貴州 凱里 556011)

氧化苦參堿對小鼠皮膚創面愈合過程中Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

鄭萍1，2，劉彥紅1，買淑霞1，姚婉霞1，2，李娟1，2，戴貴東3*

(1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.凱里學院 化學與材料工程學院，貴州 凱里 556011)

目的：觀察氧化苦參堿對小鼠皮膚創面愈合過程中Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，探討其對創面愈合的作用機制。方法：選用昆明種雄性小鼠，背部手術制備全層皮膚缺損創面模型后，隨機分為創面對照組，氧化苦參堿低、中、高劑量組(20，40，80 mg·kg-1)。以制備創面次日為第0天，分別于第3，5，7，9，11，14天處死小鼠，取背部皮膚創面組織，病理學觀察愈合情況；免疫組織化學法觀察Ⅲ型膠原蛋白的表達；Western blot檢測創面肉芽組織中Ⅲ型膠原蛋白的含量變化。結果：氧化苦參堿明顯抑制創面組織中炎癥反應，促進新生肉芽組織、毛細血管以及新生纖維膠原生長；免疫組織化學結果顯示，氧化苦參堿低劑量組在第5天，中、高劑量組在第9天顯著提高小鼠皮膚創面組織中Ⅲ型膠原蛋白的表達；Western blot結果顯示，在小鼠創面愈合過程中氧化苦參堿低劑量組在第9，11天，中劑量組在第3，5，7，9，11天，以及高劑量組在第7，9天均使創面組織中的Ⅲ型膠原蛋白顯著增加(P<0.05)。結論：氧化苦參堿能促進小鼠皮膚創面的愈合，其機制可能與提高Ⅲ型膠原蛋白的表達有關。

氧化苦參堿；創面愈合；Ⅲ型膠原蛋白

皮膚損傷的創面愈合一直是外科領域研究的熱點問題，且對于創面修復以及組織再生的研究已深入到細胞、分子及基因水平[1-2]。多年來，人們一直在為促進創面愈合、減少愈合后瘢痕形成不斷探索各種藥物及方法。

氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是寧夏苦豆子中的單體化合物，是一種具有四環喹嗪啶類結構的生物堿，具有抗心律失常、抗腫瘤、鎮痛、抗病毒、抗過敏、殺菌、抗炎等多種重要作用[3-4]。有研究表明氧化苦參堿能抑制瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、正常皮膚成纖維細胞的增殖，促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡[5]，但目前國內外尚無氧化苦參堿對創面愈合作用的相關研究報道。

膠原蛋白是細胞外基質的核心組成部分，它的產生有兩個重要的生理作用：一方面可以促進傷口的愈合；另一方面，膠原的過量沉積可導致瘢痕[6-7]。有研究指出，在傷口愈合過程中，Ⅲ型膠原蛋白出現越早，其含量越高，膠原纖維就越細，彈性也就越好，從而瘢痕也會越少[8]。本研究以背部全層皮膚缺損小鼠為實驗模型，通過對各組小鼠創面愈合時間、病理學形態觀察、免疫組化及Western blot檢測Ⅲ型膠原蛋白表達等指標的測定，動態觀察OMT對小鼠皮膚創面愈合過程中Ⅲ型膠原蛋白表達的影響。

1 材料

1.1動物

SPF級健康昆明種雄性小鼠144只，體重(22±2)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SYXK(寧)2009-0003。

1.2藥物與試劑

氧化苦參堿(寧夏紫荊花藥業股份有限公司，批號：P0100226，純度：99.8%)；凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)；Anti-CollagenⅢantibody(ab7778)抗體(Abcam公司)；兔抗β-actin抗體(北京博奧森公司)；山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術公司)；超級ECL發光試劑盒(Thermo Scientific公司)。

1.3儀器

TY96-ⅡN型超生細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；H1850R型臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；MutiskanGo酶標儀(美國ThermoFisher公司)；PowerPacBasic電泳儀(美國BIO-RAD公司)；培清JS-860B凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)。

2 方法

2.1小鼠皮膚創面制備

1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，背部去毛，暴露皮膚，用2%碘酒和75%乙醇依次消毒后，背部正中剪除全層皮膚，制備(1.5×1.5)cm2正方形傷口，創面自然干燥，止血，以制備創面次日為第0天。

2.2實驗分組及處理

昆明種雄性小鼠144只，制備創面后隨機分為4組，分別是創面對照組，氧化苦參堿低、中、高劑量組(20，40，80mg·kg-1)。創面對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，氧化苦參堿組小鼠按20，40，80mg·kg-1灌胃給予氧化苦參堿，1次·d-1，共14d。實驗第3，5，7，9，11，14天每組分別取6只小鼠稱重，戊巴比妥鈉過量麻醉處死，從創面組織正中線處剪開，取左側創面組織及周邊正常皮膚，浸泡于10%福爾馬林溶液內固定備用；取右側創面組織，液氮速凍后，置于-80℃冰箱里備用。

2.3小鼠皮膚創面愈合時間觀察

肉眼觀察創面上皮完全愈合(即創面變得很微小且無結痂覆蓋)所需時間，并記錄。

2.4病理學組織觀察

10%中性緩沖福爾馬林固定24～72h后，用流動水沖洗，然后梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋、切片(4μm)和蘇木精-伊紅(HE)染色處理。光學顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚創面組織結構的病理改變。

2.5免疫組織化學方法檢測各時間點小鼠皮膚創面組織中Ⅲ型膠原蛋白的表達水平

取創面及周邊皮膚，放入10%中性福爾馬林溶液中，固定72h后制備石蠟切片。采用免疫組化SABC法進行檢測，滴加PBS溶液1∶1000稀釋的Anti-CollagenⅢantibody(ab7778)50μL，用PBS代替一抗作陰性對照。陽性反應部位呈黃色或棕黃色，胞核復染為淺藍色。將染好的組化切片(每只動物取1張切片，每張切片至少觀察6個視野)由專業病理老師在光學顯微鏡下采用盲法進行組織學評分(Histologicalscores)并采圖。評分標準：按染色程度對各組織切片染色強度(0～3分，分別為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)、陽性細胞范圍(0～4分，分別為0、≤10%、11%～50%、51%～75%、76%～100%)進行評分，最終以分數相乘，再進行比較[9-10]。評分結果進行統計學處理。

2.6Westernblot方法檢測各時間點小鼠皮膚創面組織中Ⅲ型膠原蛋白的含量

約100mg經液氮研磨的創面組織中加入0.8mL冷裂解緩沖液，冰浴條件下超聲充分破碎細胞。4℃、10000r·min-1離心10min，取少量上清液用BCA法蛋白定量，剩余上清液統一稀釋后加入上樣緩沖液，于100℃水浴放置7min，-20℃保存。以各樣本總蛋白(100μg)上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳(80V/120V電壓)，200mA恒定電流轉膜至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入Anti-CollagenⅢantibody(1∶2000)及β-actin一抗(1∶2000)4℃過兩夜。加入山羊抗兔二抗(偶聯有HRP，1∶3000)室溫孵育2h，加入ECL試劑，然后將硝酸纖維素膜放入X光片暗盒，壓片，顯影，定影。膠片掃描結果采用Quantity-one軟件分析，將目的條帶的光密度值與其相對應的內參β-actin的光密度值相比以校正誤差，所得比值代表該目的蛋白的相對含量。

2.7統計學處理

3 結果

3.1氧化苦參堿對小鼠皮膚創面愈合時間的影響

結果顯示氧化苦參堿中劑量組愈合時間最短，為(12.3±0.5)d，比創面對照組愈合時間縮短1.4d，差異有統計學意義(P<0.05)。其余各組小鼠創面愈合時間為：創面對照組(13.7±0.6)d，氧化苦參堿低劑量組(13.0±0.6)d，氧化苦參堿高劑量組(13.6±0.5)d。

3.2氧化苦參堿對小鼠皮膚創面組織的病理學觀察

圖1HE染色結果顯示：創傷后第3天，各組小鼠皮膚創面炎性滲出比較明顯，均出現少量閘痂皮，創面皮下組織充血、水腫。創傷后第5天，創面對照組有肉芽組織長入，間質中有較多的炎細胞浸潤，可見少許新生毛細血管芽以及成纖維細胞增生，部分薄層上皮生長；氧化苦參堿各劑量組創面由較多肉芽組織填充，成纖維細胞數量較多，細胞較大，胞漿多，核仁著色明顯；間質中可見散在膠原纖維及炎細胞浸潤，中性粒細胞數量減少。傷后第7天，創面對照組的創面周圍表皮反應性增生，肉芽組織填充創面；氧化苦參堿各劑量組肉芽組織增生明顯，可見較多增生的新生毛細血管和成纖維細胞，創面周圍表皮出現輕度增生。傷后第9天，創面對照組的創面周圍表皮增生肥厚；氧化苦參堿各劑量組創面周圍表皮反應性增生，角質層增厚，創面周圍表皮增生更明顯。傷后第11天，創面對照組的創面幾乎被肉芽組織充填，創面明顯縮小，皮膚創面中纖維細胞呈細長梭狀，排列紊亂，膠原纖維增生不明顯；氧化苦參堿各劑量組創面基本愈合，且大部分創面痂皮脫落，創面基本完全為肉芽組織充填，并被新生表皮覆蓋，肉芽組織中的成纖維細胞明顯減少，代以較多纖維細胞，肉芽組織深部新生纖維膠原形成，與表皮基本平行生長，呈現有序排列。傷后第14天，各組小鼠皮膚創面均已愈合。

A.創面對照組 B.氧化苦參堿低劑量組 C.氧化苦參堿中劑量組 D.氧化苦參堿高劑量組圖1 氧化苦參堿對各時間點小鼠皮膚創面組織的HE染色圖(×100)

3.3氧化苦參堿對各時間點小鼠皮膚創面組織中Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

免疫組織化學法檢測小鼠皮膚創面組織Ⅲ型膠原蛋白的表達結果顯示：Ⅲ型膠原蛋白陽性細胞主要集中于成纖維細胞、纖維細胞的胞漿及細胞外間質表達。在創傷后，各組新生肉芽組織中纖維膠原表達部位及維持水平存在明顯差異，創面對照組在各時間點Ⅲ型膠原蛋白染色程度淺，著色數量較少；氧化苦參堿各劑量組在各個時間點Ⅲ型膠原蛋白的染色深度要深，著色細胞數量稍多。見圖2。

創面對照組Ⅲ型膠原蛋白表達呈波浪形，3d后開始下降，到5d后又開始上升，之后逐漸平穩；氧化苦參堿低劑量組在第5天時Ⅲ型膠原蛋白表達顯著升高(P<0.05)，之后未出現明顯增減；氧化苦參堿中劑量組在第5天時Ⅲ型膠原蛋白表達水平較低，之后逐漸上升，至第9天時達高峰(P<0.01)，后又呈下降趨勢；氧化苦參堿高劑量組的Ⅲ型膠原蛋白表達3d時較低表達，到第5天后逐漸上升，至第9天達高峰(P<0.05)。見表1。

A.創面對照組 B.氧化苦參堿低劑量組C.氧化苦參堿中劑量組 D.氧化苦參堿高劑量組圖2 氧化苦參堿對小鼠皮膚創面組織中Ⅲ型膠原蛋白免疫組化染色的影響(×200)

組別劑量/mg·kg-1組織學評分3d5d7d9d11d創面對照組2.67±1.631.60±0.552.80±1.792.00±0.002.20±1.10氧化苦參堿低劑量組201.80±0.442.33±0.52▲2.00±0.002.33±0.522.17±0.98氧化苦參堿中劑量組402.67±1.632.00±0.712.33±1.034.50±1.91▲▲1.80±0.45氧化苦參堿高劑量組802.17±0.411.17±0.411.80±0.453.83±2.71▲2.80±1.79

注：與創面對照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；下同

3.4 Western blot檢測氧化苦參堿各時間點對小鼠皮膚創面組織中Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

結果顯示：第3天，各組小鼠創面組織中Ⅲ型膠原蛋白均有表達，創面對照組表達較少，氧化苦參堿中劑量組Ⅲ型膠原蛋白的表達顯著增高(P<0.01)。第5天，各組小鼠創面組織中Ⅲ型膠原蛋白均有表達，氧化苦參堿中劑量組Ⅲ型膠原蛋白的表達量最高，與創面對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。第7天，創面對照組小鼠創面組織中Ⅲ型膠原蛋白表達較低，氧化苦參堿中、高劑量組表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。第9天，創面對照組蛋白表達量最低，氧化苦參堿低、中、高劑量組小鼠皮膚創面Ⅲ型膠原蛋白高表達，差異有統計學意義(P<0.05)。第11天，創面對照組小鼠皮膚創面組織內表達Ⅲ型膠原蛋白含量最低，氧化苦參堿低、中劑量組Ⅲ型膠原蛋白表達量高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

4 討論

創面愈合是一個較為復雜的過程，是機體局部和全身免疫防御、細胞再生和組織共同參與的重建過程[11]。本實驗通過采用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，剪除小鼠背部中央區域約(1.5×1.5)cm2正方形全層皮膚，制備小鼠皮膚急性創面模型。文獻報道，皮膚創面模型剪除面積<254 mm2，小鼠在14 d內可觀察到創面愈合的自然過程[12-13]，故本實驗選取14 d內觀察小鼠皮膚創面愈合情況。

在皮膚創面形成早期，機體免疫系統被激活，較多中性粒細胞浸潤，隨后出現單核細胞、巨噬細胞浸潤[14]。本實驗中，氧化苦參堿治療小鼠皮膚創面愈合的病理學顯示，氧化苦參堿能明顯減輕創傷早期(3 d時)的炎癥反應。在愈合中期5～9 d，氧化苦參堿各劑量組比創面對照組中肉芽組織填充更快，新生毛細血管增多，肉芽組織逐漸發生，促進創面早期修復[15-17]。炎癥反應貫穿創面修復的始終，氧化苦參堿通過抑制早期炎癥反應，使肉芽組織生長，促進新生纖維膠原形成對小鼠創面愈合全過程進行影響，有效地提高創面愈合。

A.創面對照組 B.氧化苦參堿低劑量組 C.氧化苦參堿中劑量組 D.氧化苦參堿高劑量組圖3 氧化苦參堿對各時間點小鼠皮膚創面組織中Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

研究發現，Ⅲ型膠原蛋白水平的增加可能與皮膚傷口再生有關，增加Ⅲ型膠原蛋白的表達可能用于預防和治療瘢痕[18]。本研究的免疫組化結果顯示，在小鼠皮膚創傷以后，Ⅲ型膠原蛋白早期相對較少；愈合后期(7，9 d時)Ⅲ型膠原蛋白相對增加。Ⅲ型膠原蛋白在氧化苦參堿低、中、高劑量組的組織學評分高于創面對照組，在愈合過程中表現出小幅波動及愈合中、后期緩慢增加的趨勢。Western blot結果顯示，各組小鼠創面在傷口愈合初期(3 d時)即開始分泌Ⅲ型膠原蛋白，但含量較少，而在愈合過程中出現波動，愈合后期(9，11 d時)增高，這與Ⅲ型膠原蛋白在傷口愈合過程中表達規律基本一致。本實驗中，創面對照組Ⅲ型膠原蛋白在整個愈合過程中表達量均比氧化苦參堿各組Ⅲ型膠原蛋白整體表達量低，提示氧化苦參堿可能通過提高創面纖維蛋白含量，參與創面愈合的各個階段，促進細胞生長活性及基質形成，從而調動吞噬系統清除病菌與組織碎片，對創面的上皮被覆起到促進作用，促進創面愈合。

綜上所述，創面愈合過程復雜，影響因素眾多，而氧化苦參堿對小鼠創面愈合過程中的肉芽組織生長、新生膠原纖維、Ⅲ型膠原蛋白等都產生了一定的促進作用，從而促進創面愈合。但當前的研究仍處于較低水平，許多具體環節仍有待進一步深入，對于促進創面愈合的作用機理仍需進一步研究。

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EffectofOxymatrineontheExpressionofCollagen-ⅢonSkinWoundHealinginMice

ZHENG Ping1，2，LIU Yanhong1，MAI Shuxia1，YAO Wanxia1，2，LI Juan1，2，DAI Guidong3*

(1.School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；2.Ningxia Engineering & Technology Research Center for Modernization of Hui Medicine，Yinchuan 750004，China；3.School of Chemical and Materials Engineering，Kaili University，Kaili 556011，China)

Objective：For the purpose of studying oxymatrine on the expression of Collagen-Ⅲ on skin wound healing in mice，and exploring its mechanism.Methods：Male Kunming mice were randomized to four groups：control and OMT 20，40 and 80 mg·kg-1groups.At 0，3，5，7，9，11 and 14 days,the mice were killed，the back skin were gotten.All wound tissue were analyzed by hematoxylin-eosinstaining(HE)and Collagen-Ⅲ expression in wound tissue were analyzed by immunohistochemical staining.Collagen-Ⅲ expression in wound tissue was detected by western blot analysis.Results：Oxymatrine inhibited wound tissue inflammation；promoted granulation tissue，capillaries and the growth of nascent collagen fibers. The results of immunohistochemistry showed that the expression of Collagen-Ⅲ was increased in the oxymatrine-treated group(20 mg·kg-1at 5 d；80 mg·kg-1at 9 d).The Collagen-Ⅲ indicated by Western Blotting was increased(20 mg·kg-1at 9，11 d；40 mg·kg-1at 3-11 d；80 mg·kg-1at 7，9d).Conclusion：Oxymatrine can promote wound healing in mice skin and the mechanism may increase the expression of Collagen-Ⅲ.

Oxymatrine；Wound healing；Collagen-Ⅲ

*

戴貴東，教授，博士，碩士生導師，研究方向：心血管藥理和腫瘤藥理；Tel：(0855)8558093， E-mail：daiguidong@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.006

2014-05-28)