基于化學指紋圖譜的藥用植物種質資源多樣性評價△
——以黔產川續斷種質資源評價為例

江維克，周濤，肖承鴻，楊昌貴，艾強

(貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002)

中藥農業

基于化學指紋圖譜的藥用植物種質資源多樣性評價△
——以黔產川續斷種質資源評價為例

江維克*，周濤，肖承鴻，楊昌貴，艾強

(貴陽中醫學院，貴州 貴陽550002)

目的：以指紋圖譜的指紋峰面積為參數，探討藥用植物種質資源多樣性評價方法。方法：以黔產川續斷為例，對其HPLC指紋圖譜進行標準化處理，利用相關軟件計算指紋峰面積多樣性、指紋峰之間相關性分析以及主成分分析，并進行不同種質之間的聚類分析。結果：各指紋圖譜峰的峰面積表現出不同程度的多樣性；大多數指紋峰面積之間呈顯著的相關性；主成分分析結果表明，第一主成分反應了川續斷的品質特征；聚類分析顯示歐式遺傳距離與種質資源的空間距離無關。結論：以指紋圖譜為指標對藥用植物進行多樣性評價，可以揭示藥用植物種質資源多樣性規律和結構，同時還能反映藥用植物種質資源的內在質量，與其他研究藥用植物的遺傳多樣性的方法相比，具有明顯的特色。

指紋圖譜；多樣性；種質資源；藥用植物；川續斷

多樣性評價研究是種質資源研究的主要內容之一，其方法主要有分子標記、農藝性狀、同工酶等，對藥用植物的研究而言，這些方法往往與藥材的內在品質沒有直接的關聯。化學指紋圖譜代表中藥化學成分分布比例和含量特征、潛在的生物活性和藥效量化特征，與中藥藥效作用的整體性相一致。盡管圖譜中大量指紋峰還無法一一辨認，但其仍然是藥用植物內在質量和化學特征的最好表征，指紋峰猶如植物的農藝性狀，或者分子標記中的條帶，能很好地表現出藥用植物種質資源的多樣性，同時還能反映藥材的內在質量，具有明顯的特色。本文以黔產川續斷的HPLC指紋圖譜為例，探討以指紋峰面積為參數評價藥用植物多樣性的方法。

1 材料和方法

1.1材料

2011年10月～12月，在貴州省22個川續斷居群進行采樣，每個居群采集5～10個單株，共152份樣品，樣品信息見表1。樣品均經鑒定，為川續斷科植物川續斷DipsacusasperWall.ex Henry。樣品采集后，洗凈，50℃烘至半干，密閉發汗至藥材斷面變綠后再烘干，粉碎成細粉。

表1 樣品信息

1.2儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20AD，日本島津)；電子天平(EL104，瑞士METTLERTOLEDO)；乙腈(色譜純，Tedia公司)；川續斷皂苷Ⅵ對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111685-200401)。

1.3色譜條件

UltimateXB-18色譜柱(250mm×4.60mm，5μm)；以乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)為流動相，體積流量0.8mL·min-1。梯度洗脫：0～30min，9%～21%A；30～65min，21%～22%A；65～90min，22%～60%A。檢測波長212nm，柱溫30℃；進樣量10μL。

1.4溶液的制備

對照品溶液：用甲醇溶解制成含量為0.1690mg·mL-1的對照品溶液。

供試品溶液：取川續斷藥材粗粉約1g，精密稱定，置于100mL錐形瓶中，加入70%乙醇50mL，稱定重量，回流提取2h，放冷，補足減失的重量，濾過，取續濾液過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.5黔產川續斷化學指紋圖譜的建立

將測定的152份川續斷樣品圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”，以樣地1(黔南州龍里縣1)中的1號樣本作為參照圖譜，選擇80%樣本都有、且峰面積超過10000的峰作指紋圖譜峰，結果得到指紋圖譜峰16個，以fAi表示，其中第16號峰(fA16)為川續斷皂苷Ⅵ，見圖1。

圖1 1號川續斷樣品(A)及對照品川續斷皂苷Ⅵ(B)的HPLC圖

1.6指紋峰面積的標準化處理

對每個樣本的指紋峰面積進行標準化處理，得到每個樣本標準化指紋峰面積Aijs，Aijs=Aij/(WiAS)，其中Aij為第i個樣本的第j個峰面積，Wi為第i個樣本的取樣量(g)，AS為對照品的峰面積。

1.7數據分析

采用SPSS17.0軟件，計算Aijs的平均數(Xjs)、標準差(Sjs)、極差(Rjs)、變異系數(CVjs)等統計學參數和遺傳多樣性指數(H′)。遺傳多樣性指數采用Shannon-Weiner index(H′)指數，計算公式為：H′=-∑Pk×lnPk，式中Pk為某j個峰標準峰面積在第k級別出現的頻率(先在[Xjs-2Sjs，Xjs+2Sjs]區間等分為10等級，統計各標準化面積在各等級中的分布頻率)[1]。主成分和聚類分析采用DPS7.0軟件，種質間遺傳距離為歐氏距離。

2 黔產川續斷種質資源多樣性的化學指紋圖譜分析結果

2.1川續斷化學指紋峰多樣性分析

黔產川續斷各指紋圖譜峰的峰面積表現出不同程度的多樣性，16個指紋圖譜峰的平均多樣性指數為1.8365，fA總的多樣性指數為2.0639，fA16(川續斷皂苷Ⅵ)的多樣性指數為1.7523。16個指紋峰面積的變異系數均大于40%，fA總的變異系數為40.32%。fA16的峰面積變異系數為77.03%。一方面說明黔產川續斷藥材質量差異較大，需要全面對種源進行篩選和歸類，另一方面也反映黔產川續斷種質資源的遺傳改良利用的潛力較大，對有目的的尋找選育目標性狀與成分的種質具有重要意義，見表2。

表2 川續斷16個指紋圖譜峰的多樣性分析(n=152)

2.2 川續斷化學指紋圖譜各指紋峰之間的相關性分析

各指紋峰面積間存在不同程度的相關性，每一個指紋峰面積至少與9個指紋峰的峰面積顯著相關；這種相關性是川續斷中各化學成分含量之間相關性的直接表現，可以推測，指紋峰面積與農藝性狀的指標相似，是受相關基因表達或環境影響的結果。結果見表3。

表3 川續斷16個指紋峰的相關性分析(n=152)

注：上標1)在0.05水平(雙側)上顯著相關；2)在0.01水平(雙側)上極顯著相關

2.3川續斷化學指紋圖譜的主成分分析

前6個主成分累計貢獻率為70.093%，包含了川續斷指紋圖譜的絕大部分信息。第1主成分貢獻率最大，其特征向量中載荷大且符號為正的指紋峰中包含了峰面積較大的四個指紋峰(fA3、fA10、fA11、fA12)，因此第1主成分表征了影響川續斷質量的主要因子；第2主成分在特征向量中載荷大且符號為正的指紋峰包含了川續斷皂苷Ⅵ的指紋峰；第3～6主成分在特征向量中載荷大的指紋峰較少；fA總與fA3、fA4、fA9、fA10、fA11、fA12、fA15峰面積的變化趨勢極其相似，這與相關性分析結果基本一致。見表4。

2.4川續斷化學指紋圖譜的的聚類分析

對152份樣本進行聚類分析，以歐式距離為遺傳距離，在距離30處將供試材料聚為4大類群，見圖2，以下又可分為不同的亞類(在此對亞類不作細分)。川續斷各種質類群的特征見表5。

第Ⅰ類群主要包含11個產地的樣本，為地理分布廣的類群，其主要特征是指紋峰面積的平均多樣性指數和總峰面積的多樣性指數最高，進一步佐證了多樣性是藥用植物適應環境生長的主要因素。同時提示該類群作為良種選育的潛力較大。

第Ⅱ類群主要包含3個產地的樣本，其主要特征是指紋峰fA2、fA13、fA14、fA16的峰面積平均值最高，其中fA16為川續斷皂苷Ⅵ，表明川續斷皂苷Ⅵ成分含量較高，可作為川續斷皂苷Ⅵ含量高的種源加以利用。

表4 川續斷16個指紋峰的主成分分析(n=152)

圖2 基于指紋峰面積的川續斷種質資源聚類圖

峰ⅠⅡⅢⅣAverageCV/%H'AverageCV/%H'AverageCV/%H'AverageCV/%H'fA10.13488.601.82130.10978.101.96170.16374.071.84200.12938.631.8946fA21.55477.931.80722.26244.862.01121.33387.551.63911.44377.551.6217fA38.96349.382.03326.24149.301.871414.79631.801.96762.11650.341.9870fA40.24847.931.90740.20167.371.77510.33140.471.75610.023181.200.6809fA50.60069.121.91250.64092.411.66680.71295.291.70070.48429.621.9475fA60.60756.872.04670.87452.291.76150.62749.061.92741.16053.781.6749fA70.17961.742.03140.18373.341.85390.19594.411.77670.016192.131.0377fA80.12858.511.94080.12392.761.69070.12260.621.74460.041159.911.3505fA91.28859.201.93970.69387.871.90502.71851.871.90300.61564.032.0219fA107.69847.171.95374.79060.451.756110.23947.331.84082.58068.461.7447fA119.91630.382.07298.00450.011.937812.69131.431.90403.12758.321.8946fA129.78055.431.83734.96039.241.981812.53242.931.74732.62362.261.7673fA131.09666.481.90571.55279.421.92850.92258.621.94421.07364.521.7957fA140.331145.341.20080.379205.340.51580.27379.101.63910.11658.351.7673fA150.92158.601.81470.77176.471.58311.27458.221.59670.41288.291.3175fA161.34773.181.66651.47185.851.61521.35451.881.85130.46658.912.0219fA總44.79127.502.086933.25231.491.875260.28026.701.951316.42442.071.6929平均2.79965.371.86822.07877.191.73853.76859.661.79881.02681.641.6579

第Ⅲ類群主要包含6個產地的樣本，該類群的指紋峰面積的平均值最大，說明此類群的藥材整體化學成分含量較高，內在品質好，是值得引種馴化的種源。

第Ⅳ類群主要包含2個產地的樣本，該類群指紋峰面積的平均值小、變異系數大、多樣性指數最低，說明此類群藥材整體化學成分含量低，內在品質差。同時分布也較窄。

3 討論

黔產川續斷的化學指紋圖譜有豐富多樣性，與筆者前期采用SRAP分析的結果一致[2]，指紋圖譜的多樣性是通過各指紋峰面積的差異表現的，即對應的化學成分的含量差異；同時，指紋峰面積之間具有明顯的相關性，各指紋峰面積的大小并不是孤立的，而是受到其他指紋峰面積大小的制約，顯示出任何一個指紋峰不是受到單一因素或一個基因控制，而是受到多因素或多基因的調控。

通過主成分分析可以挖掘出在某些特征起主要貢獻的指紋峰，例如，第1主成分包含了平均面積最大的4個指紋峰，顯然代表了川續斷內在質量的主要因素，通過比較第一主成分，即可大致分析出不同類群川續斷的質量差異。

聚類分析顯示，川續斷種質間遺傳歐氏距離的遠近與川續斷種質資源的空間距離并不一致，相關指紋峰面積與種質資源空間的關系完全是隨機的，這與筆者前期的研究相一致[3]。特征指紋峰面積平均值、變異系數、多樣性指數等參數，表示了每一類群種質資源的內在質量差異和多樣性的特征。指紋峰面積大、變異系數小、多樣性指數低，說明該類群的質量好且比較穩定，是比較適合引種馴化的類群；指紋峰面積大，但變異系數大、多樣性指數較高的類群，可能包含豐富的基因類型，是優良品種選育的優質種質資源。

植物的遺傳分化即基因或染色體的變異有不同的表型形式，包括化學成分的組成和含量的變化[4]。由于受其本身的遺傳結構和所處生態環境影響，植物的形態和次生代謝物既具有變異性又具有穩定性，這是一個種群生存、發展和進化的基礎，也是生物多樣性具體體現的重要方式[5]。化學指紋圖譜是一種能比較全面地反映中藥中化學成分分布比例和含量特征的方法[6]，盡管化學指紋圖譜中有大量指紋峰還無法一一辨認，但每個指紋峰與農藝性狀相似，受多基因和環境的影響，在數值上呈連續分布，指紋峰面積之間有不同程度的關聯，能夠反映出基因型上的變異和環境的影響。因此，利用指紋圖譜對藥用植物的種質資源進行多樣性評價，與其他多樣性評價方法相比，還可以同時顯示中藥成分的差異，可以更好地指導藥用植物種質資源的開發利用和保護；如果結合植物化學分類學理論，將指紋圖譜對多樣性評價方法擴展到更高的分類等級，例如屬或科的樣本進行指紋圖譜多樣性分析，也可能為分類系統的建立提供依據。

[1] 顧萬春.統計遺傳學[M].北京：科學出版社，2006：158.

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ANovelMethodforGermplasmDiversityEvaluationofMedicinalPlantBasedonChemicalFingerprint：ACaseStudyonDipsacusasper

JIANG Weike*，ZHOU Tao，XIAO Chenghong，YANG Changgui，AI Qiang

(Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China)

Objective：To create a novel method for germplasm diversity evaluation of medicinal plant based on the chemical fingerprints.Methods：An example ofDipsacusasperin Guizhou，the fingerprint peak areas were standardized，then the diversity of fingerprint peak area，the correlation between fingerprint peaks and the principal components，and the cluster analysis of the different germplasm resources were analyzed by SPSS 17.0 and DPS 7.0.Results：There were abundant diversity of fingerprint peak areas and close correlation among each fingerprint peaks which could offer help to quality evaluation ofD.asper.The principal components analysis of the fingerprint peaks showed that the first principal component obviously reflected the inner quality ofD.aspercharacteristics.The cluster analysis showed that the euclidean genetic distance had nothing to do with the space distance of germplasm resources.Conclusion：The germplasm diversity evaluation based on the chemical fingerprints could reveal the diversity regularity and structure of medicinal plant germplasm.Meanwhile，it reflected the inner quality of medicinal plant germplasm resources.

Fingerprints；Germplasm diversity；Germplasm resource；Medicinal plant；Dipsacusasper

國家自然科學地區基金項目(81160501)；國家十一五科技支撐項目(2009BA174B01)；貴州省普通高等學校特色重點實驗室建設項目(黔教合KY字[2013]108號)

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江維克，教授，研究方向：中藥資源鑒定與評價；Tel：(0851)5622506，E-mail：jwk_88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.008

2014-07-31)