白及種子試管高頻萌發的應用研究△

宋曉丹，陳曉玲，尚麗，楊培君

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

白及種子試管高頻萌發的應用研究△

宋曉丹，陳曉玲，尚麗，楊培君*

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

目的：探討適合白及種子試管高頻萌發及壯苗生根的培養條件，以獲得大量種苗。方法：采用白及當年未裂開的成熟果實，經表面消毒處理，通過MS的不同組方培養基，開展種子試管萌發和生根培養。結果：適合白及種子試管苗高頻萌發環境為光環境，最佳萌發培養基為MS+NAA 1.0 mg·L-1+AC 6.0 g·L-1，萌發率可達98%以上；1/2 MS培養基適合壯苗及易于生根培養，生根率達95%以上；平均移栽成活率可達85%。結論：白及組培研究雖有報道，但本研究結果提供了一種簡單、快速、實用的白及種子試管快速萌發技術，有助于推動白及規模化人工種植產業的發展。

白及；種子；試管萌發

白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.為蘭科白及屬多年生草本植物，又名白芨；產陜西南部、甘肅東南部、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川和貴州；生于海拔100～3200 m的常綠闊葉林下，櫟樹林或針葉林下、路邊草叢或巖石縫中，朝鮮半島和日本也有分布[1-2]。白及塊莖為我國傳統中藥材，具收斂止血，消腫生肌功效；用于咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂[3]。白及不僅在醫藥上用途廣泛，在化妝品上也有廣泛的應用[4]，白及膠在醫學研究和臨床等諸多方面有廣泛的應用，在治療胃、食道炎及十二指腸潰瘍和穿孔、出血糜爛性胃炎等效果顯著[5]；白及粉粒是一種理想的肝癌血管栓塞劑[6]；白及還可外用于凍瘡和皮膚皸裂等[7]。白及膠具有補充肌膚營養，消除體內過量自由基，延緩肌膚衰老的作用[4]。此外，白及花色艷麗，也具良好的觀賞價值，市場前景廣闊。

蘭科植物種子萌發率極低，須有相適應的真菌侵染種子后，才能提高種子的自然萌發率[8]。白及自然繁殖困難，野生資源稀少，是我國一種珍稀保護植物資源[9]。由于白及用途廣泛，其需求量較大，而長期采挖導致野生資源急劇減少，無法供應市場需求；目前，白及主要依賴人工栽培，多以小塊莖作為繁殖材料。有關白及的組織培養研究已有許多報道[10-14]，但存在培養過程復雜、周期長、成本高、不易應用等問題。本實驗采用白及成熟果實的種子為材料，在不同培養基上進行無菌播種，利用試管培養的方法進行誘導種子萌發、壯苗生根，篩選出適合種子萌發及試管苗培養的最佳條件，為白及的規模化生產提供一種簡單、有效、低成本、應用性強的種子試管高頻萌發與擴繁技術。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為白及成熟未開裂果實的種子，2013年10月采自于陜西留壩縣江口人工種植的優良白及成熟蒴果。

1.2 方法

1.2.1 材料無菌處理 取白及成熟蒴果，將2～3個果實置于紗布包好，自來水沖洗6～8 h；在凈化工作臺中用無菌水沖洗1次，75%乙醇消毒30 s左右，無菌水沖洗1次；0.1%升汞中浸泡10～11 min；無菌水沖洗3～4次。

1.2.2 種子萌發誘導 將消毒處理后的白及成熟果實先端切開，適量種子均勻撒布于萌發培養基表面。實驗設計的種子萌發誘導培養基有：1/2 MS，1/2 MS+GA 0.5 mg·L-1，1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1，MS+NAA 1.0 mg·L-1；并將培養基分成2組，其中1組添加活性炭(AC)4.0～6.0 g·L-1。以此比較、篩選適合白及種子有效萌發的培養基以及培養條件。

1.2.3 壯苗生根培養 選取光照條件下培養40 d左右，高度約1.5～2.0 cm并有葉片展開的白及試管苗，將其轉接到篩選出的1/2 MS培養基中，每培養瓶接5～7株小苗，進行壯苗及誘根生長的培養。

1.2.4 培養條件 萌發誘導及壯苗條件：前20 d分三組培養，一組為暗環境人工氣候箱培養(遮光處理，溫度23 ℃，濕度80%)；另一組為光環境人工氣候箱培養(光照：40 μmol·m-2·s-1，溫度23 ℃，濕度80%)；第三組為弱光室溫培養(培養室內弱自然光：20 μmol·m-2·s-1，室溫20～10 ℃，濕度65%)。后期培養溫度為24±2 ℃，相對濕度66%～85%，光照12 h·d-1，光照強度為40 μmol·m-2·s-1。

1.3 結果觀察與統計

統計每種培養基中種子萌發數及萌發誘導率，觀察不同培養基對苗的影響及生長情況。萌發誘導率=萌發種子數/接種數×100%。

2 結果與分析

2.1 種子萌發誘導

在實驗的各培養基上，白及種子的最大萌發率能達到100%。但因培養基所加的激素及培養條件的不同，導致促萌發時間長短不一，萌發率以及幼苗生長狀況有差異。

種子萌發與光的關系一直受到廣泛關注[15]。白及種子培養10 d時，光環境下的種子開始出現萌發跡象，種子吸脹并由黃褐色變成綠色；20 d時綠色芽點顏色明顯變深，黃褐色消失；25 d時接近最大萌發率，綠芽周圍出現細小白色毛狀物，第一片幼小真葉長出(圖1：4，5)，培養40 d后，可生長2～3片幼葉(圖1：6)。相比之下，室溫弱光環境中的白及種子在第15 d時開始萌發，暗環境下的種子在20d后開始萌發。暗環境中的種子整體萌發比光照環境中的萌發晚，且在同種培養基中萌發率也低于光照環境中。結果表明光照有利于促進白及種子的萌發。

活性炭具有促進組培苗植物生根的作用[16]。根據表1的種子萌發率可知，在同一培養基、同一培養環境下，含活性炭的培養基中白及種子萌發率明顯高于不含活性炭的培養基。白及種子在光環境下，以MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)培養基中萌發率最高，可達到100%，且幼苗粗壯；1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)培養基中萌發率次之，達95%以上，幼苗纖細；自然環境中兩種培養基上的種子萌發率也相對較高，分別是71.4%和80.0%；暗環境中的種子萌發率最低，僅有21.0%和32.4%(表1，圖1：1～6)。

綜上所述，培養基組份、光照和溫度對白及種子萌發均有明顯的影響。適合白及種子試管高頻萌發誘導的條件為光環境培養，最佳培養基為MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)。

1～3.白及種子在MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)培養基、光照條件下萌發，分別為10d，25d，35d；4～6.白及種子在1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1培養基、光照條件下萌發，分別為15d，30d，40d；7～10.白及在1/2 MS培養基中生根壯苗，分別為15d，30d，50d，70d；11.白及試管苗，50d；12.移栽于植苗盤中幼苗的生長與管理圖1 白及種子高效試管萌發培養

表1 不同培養條件對白及種子萌發率的影響(25 d)

注：+表示含有活性炭，-表示沒有活性炭。

2.2 壯苗生根培養

取生長狀況良好且長勢相當，苗高1.5 cm左右，有葉片展開的幼苗轉接到1/2 MS壯苗生根培養基中，每個培養基瓶中接5～7株幼苗，培養條件為光照40 μmol·m-2·s-1，12 h光照，培養溫度25±2℃。經30 d培養后，幼苗粗壯，長勢均勻，葉片較寬；產生根1～3條，根長3～5 mm，并且基部產生直徑2～3 mm的小塊莖(圖1：7～9)。培養50 d后，根長達15～20 mm，小塊莖迅速膨大，有的基部可產生2～3個塊莖(圖1：10～11)。

2.3 移栽

當試管苗生長至4～5 cm高，根系發達且根部有膨大的塊莖時移栽效果最好。此時，先解開封口膜扎繩1～2 d后，松開封口膜，但不是完全去掉；再經2～3 d移去封口膜，煉苗3～5 d后即可移栽。

選用植苗盤，先覆好基質，澆足水；移苗基質為腐殖土和壤土加沙土(1∶1)。移栽時，從培養瓶中小心取出苗，用清水沖洗掉根部的培養基，避免傷害根系；用鑷子在基質上扎1小穴，將苗栽入，覆好基質。將移栽好小苗的植苗盤置于塑料膜大棚內，每天適量灑水，保持空氣濕度，并適時打開通風口換氣(圖1：12)；30 d后正常田間管理。為了促進苗的健壯和生長速度，可采用1/4 MS營養液進行葉面噴灑。

3 討論

目前，有關白及的種子萌發與白及組織培養研究已有不少的報道。管常東等[10]綜合了2010年前有關白芨的組培快繁育苗技術研究進展；張燕等[12]研究報道了白芨種子在不同培養基上的萌發過程和幼苗形成的形態學特征。但尚無白及種子直接試管高頻萌發技術的應用報道。

本研究結果表明，1/2 MS、MS培養基及添加不同生長調節劑和不同培養環境對白及種子萌發誘導存在差異；光照和溫度對白及種子試管萌發有明顯的影響。適宜白及種子試管高頻萌發的環境為光環境，且添加活性炭有利于促進白及種子的萌發，此結果與葉靜等[11]認為活性炭有利于促進白及種子萌發研究結果相似。篩選的白及種子試管高頻萌發的誘導的最佳培養基為MS+NAA 1 mg·L-1+AC 6 g·L-1，而適合白及試管壯苗生根及小鱗莖生長的培養基為1/2 MS培養基。

白及不僅藥用價值高，而且具觀賞價值，是我國醫藥工業和化妝品工業的重要原材料。隨著我國中醫藥事業的發展，白及的臨床應用范圍不斷擴大，藥用需求也急劇增加。由于白及種子非常細小且無胚乳，在自然條件下萌發困難，繁殖效率低。目前人工種植種群擴大的主要方式為分株繁殖[17]，但形成商品需3～5年，自然增長率遠低于市場需求的增長。優質種源是制約人工種植白及的瓶頸，所以開展白及種子的試管萌發研究，提供一種簡單、快速、成本低、應用性強的白及種子試管高頻萌發技術很有必要，可保障優質種苗供給，從而推動白及規模化種植產業的發展。

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StudyonEfficientSeedGerminationofBletillastriatainvitro

SONG Xiaodan，CHENXiaoling，SHANGLi，YANGPeijun*

(SchoolofBiologicalSciencesandEngineering，ShaanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，China)

Objective：To study the suitable culture conditions for efficient seed germination ofBletillastriatain vitro and seedling growth，and to obtain a large number of seedlings.Methods：Using mature fruits ofB.striatatreated by surface disinfection，seed and seedlings were cultured on MS media with different components.Results：The suitable conditions for efficient seed germinating were to culture under light on MS+NAA 1.0 mg·L-1+AC 6.0 g·L-1.Under this condition，germination rate reached more than 98%；1/2 MS medium was suitable for shoot growing and rooting culture.Rooting rate was up to 95%.Transplanting survival rate was 85% on average.Conclusion：There were a few of tissue culture research reports onB.striata，but this results provided a simple，rapid and practical technology for seed germination ofB.striatain vitro，helping to promote the large-scale artificial planting.

Bletillastriata；Seed；Germination in vitro

2014-05-12)

國家中醫藥公共衛生專項(201207002)，大學生創新創業訓練計劃項目(UIRP12020)

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楊培君，教授，研究方向：植物生物技術研究；E-mail：yang@snut.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.09.010