基于熒光卟啉傳感器陣列系統的肺癌標志物檢測研究*

雷靳燦， 侯長軍， 霍丹群

(重慶大學 生物工程學院，重慶 400030)

0 引 言

肺癌是最常見的肺原發性惡性腫瘤，在全球范圍內表現出高發病率和高死亡率，每年奪去上百萬人的生命[1]，資料顯示，這個數據還在不斷增加[2～4]。由于多數肺癌早期無明顯癥狀，而出現咳嗽、痰血等癥狀時被檢出來已是中晚期，使得在5年生存率不到15 %[5]，因此，對肺癌高危人群的篩查就顯得很有必要。然而，目前臨床上對肺癌早期的檢測手段主要依賴于X線,CT，MRI，PET等影像學手段。這些方法雖然無創，但價格昂貴，且對人體有一定危害，早期檢出率也并不理想，不適合廣泛用于肺癌篩查[6]。

Pauling L等人在1971年提出了肺癌呼出氣體檢測[7]，在早期檢測和篩查中具有廣泛的應用前景，引起學術界的廣泛關注。研究表明，呼出氣體中的一些揮發性有機氣體(VOCs)與是否患有肺癌以及肺癌的分期有著密切的關系[8,9]，并已經確定了呼出氣體中的一些肺癌標志物[8,10～12]。近年來，越來越多的研究小組設計了針對肺癌相關VOCs的傳感器[13～15]，這也成為該領域的重要發展方向。鑒于卟啉具有光敏特性好、響應速度快、性能穩定，采用光譜技術可以檢測到它的微小變化等優點[16]，本文提出了一種與以往不同的熒光卟啉傳感器陣列系統，通過卟啉敏感材料與待測物之間的交叉響應機制，對不同肺癌標志物有著相當好的識別效果。利用自主研發的熒光卟啉傳感器陣列系統，對不同體積分數的對二甲苯、苯乙烯、異戊二烯、己醛這4種肺癌標志物進行了識別區分，期望為后續臨床研究提供一定的支持。

1 實驗設計

1.1 傳感器陣列

本文使用的熒光卟啉交叉響應傳感器陣列由敏感物質和基底材料構成。敏感物質均由重慶大學生化傳感中心自助合成并提供。首先通過熒光分光光度計分析各標志物與敏感物質溶液相互作用后的熒光光譜變化；然后將敏感物質附于作為基底材料的聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，并根據熒光分光光度計的結果選用特定波長的3個激光LED燈作為激發光源，配合微型光纖光譜儀進行測試。通過前期研究的大量實驗，篩選出包含卟啉、卟啉衍生物及指示劑染料在內的共15種對肺癌呼出標志物有不同熒光光譜響應的敏感物質。為便于系統設計，它們按圓形排列在直徑為47mm的PVDF膜上，構成熒光卟啉傳感器陣列。

1.2 系統構成

設計的熒光傳感器陣列檢測系統原理如圖1所示。

圖1 熒光傳感器檢測系統原理圖

系統上電后，微型PC發送控制指令使各硬件初始化。作為背景載氣的惰性氣體N2在氣泵的作用下進入反應氣室，各激光LED按一定流程打開關閉，傳感器陣列在步進電機帶動下旋轉，微型光纖光譜儀依次測量各敏感點反應前的熒光光譜。隨后，用N2配好體積分數的待測氣體進入反應氣室與傳感器陣列發生反應，待反應達到平衡后微型光纖光譜儀采集反應后的熒光光譜。反應前后的熒光光譜數據送入PC機，計算各敏感點的差譜并進行分析處理。測量結束后氣體送入廢氣處理缸。

1.3 實驗氣體

本文通過設計的系統對選擇的4種曾在多篇文獻中被確定為肺癌呼出標志物的VOCs進行檢測。標志物由Sigma-Aldrich公司購得的分析純使用N2作為背景氣體，將其配置成4種不同的體積分數梯度，如表1所示。

表1 肺癌標志物及其體積分數

2 數據處理方法

對于每次待測VOCs的檢測，系統將自動給出各敏感點反應前后的熒光差譜數據，記為X1，X2，…，X15。結合光譜分析技術和信號處理技術，本文在熒光差譜的空間域上選取了3個特征指標：峰峰值、最大峰位置、積分面積，分別記為：PPV(peak-to-peak value),MPP(maximum peak position),IA(integral area)，如圖2所示。

圖2 熒光差譜的空間域特征

峰峰值、最大峰位置描述的是光譜的個別局部點的特征，積分面積描述的是光譜的宏觀特征。而對于復雜系統而言，特別是本文中基于交叉響應機制的識別，從信號分析處理的角度，還有必要關注其局部微觀特征，本文借助具有“數學顯微鏡”之稱的小波理論中的小波包進行分析。使用db4小波包對Xi進行三層分解，熒光差譜信號被分解到多個頻率，在各尺度空間內的平滑信號和細節信號能提供原信號的時頻局部微觀信息，特別是原始信號在不同頻段上的構成信息。因此，把不同頻段上的信號能量求出，便可作為熒光差譜信號的一組模式識別特征指標。記末層各頻帶重構信號為Sm(m=1,2,…,8)，則各頻帶重構信號能量為

(1)

式中n為熒光差譜數據長度。至此，對于每個敏感點均得到11個特征值：PPV，MPP，IA，E1～E8，將陣列上15個敏感點的特征值寫成向量形式，便構成了目標氣體可用于模式識別的特征向量，記為Y，顯然，Y是一個11×15=165維向量。

3 結果與討論

3.1 響應熒光差譜

本文對上述4種體積分數的4種標志物進行實驗，每種標志物每種體積分數均測試10次，實驗中設定標志物與熒光傳感器陣列的反應時間為15 min。通過系統給出的熒光差譜可以發現，不同標志物的熒光差譜圖之間具有明顯的差別。以對二甲苯為例，4種體積分數下的熒光差譜如圖3所示。

圖3 各體積分數下對二甲苯的熒光差譜

可見，隨著濃度的增加，各敏感點的熒光差譜變化逐漸增大，但是，只有6個固定的特征點有熒光的變化，它們是X1，X4，X5，X8，X12，X15。其它3種標志物也有類似的規律，即只有固定的敏感點會產生熒光變化，說明系統對不同肺癌標志物響應的熒光差譜圖各不相同，具有一一對應關系，這便構成了不同標志物的特有的指紋熒光差譜圖，如圖4所示。利用這個特點，可以對不同肺癌標志物進行識別。

圖4 不同肺癌標志物的指紋熒光差譜圖

3.2 層次聚類分析

層次聚類分析(HCA)是一種多元統計分析方法，能夠將所觀察的數據集內的數據按照相似性的大小將它們聚集成族，從而達到分類的目的。它能在缺乏先驗知識的情況下根據數據的特點合理進行聚類，可作為小樣本下無監督型模式識別的有力工具。本文從上述實驗中的4種標志物的20個樣本中分別隨機抽選5個，將它們的熒光光譜特征值Y作為輸入進行層次聚類，結果如圖5所示。

圖5 4種肺癌標準物的層次聚類分析圖

顯然，4種肺癌標志物能夠準確無誤的聚集。經過多次隨機抽取，重復聚類，沒有錯誤現象。

3.3 主成分分析

雖然HCA能夠將不同肺癌標志物進行正確的區分，但由于特征向量Y的維數很高，這無疑將使得計算的復雜度較大，有必要對數據進行降維處理。主成分分析(PCA)的基本原理就是通過把各特征值進行不同的線性組合構建出新的指標，即主成分，各主成分之間相互正交，這就使得能夠用最少的變量反映最多信息量成為可能。通過PCA對上述160次實驗的數據進行分析，一共提取到16個主成分，前3個主成分對原特征向量所包含信息的累積貢獻已達88 %，按照大于85 %的原則，文本只提取前3個主成分PC1，PC2，PC3，圖5中的樣本數據在以前3個主成分為坐標的坐標系中的散點圖如圖6所示，可見前3個主成分所代表的信息可以將不同肺癌標志物進行正確區分識別，能夠達到降低維數，簡化計算的目的。

圖6 前3個主成分的樣本散點圖

4 結 論

本文提出了一種基于熒光卟啉傳感器陣列的肺癌呼出標志物檢測系統，并據此對4種已確定的標志物進行檢測，按照設計的數據處理方法提取了其特征向量，得到了其特有的指紋熒光圖譜。根據HCA,PCA等技術手段對它們進行了識別區分，得到了理想的分類效果。HCA結果顯示，所有樣本均能夠正確的聚到一起。通過PCA，在前3個主成分所代表的88 %信息量的散點圖上便可將樣本明顯的區分。研究表明:該熒光卟啉傳感器陣列系統能夠快速有效的對肺癌標志物進行檢測識別,若通過大量實驗建立完整的肺癌標志物特征數據庫，有望在臨床上應用。

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