我國北部灣部分海產品中副溶血弧菌的基因分型研究

韋強+李毅財

摘要利用RAPD技術對北部灣分離的24株Vp進行基因分型。結果顯示：RAPD可以分離出7~11條不同的條帶，大小0.45~1.50 kb。聚類分析結果表明在相似度為0.84時，RAPD分辨力指數為0.931。采用通過POPGENE 32軟件對比了24株Vp的各種遺傳參數，結果表明：RAPD的Shannon信息指數、有效等位基因數、Nei基因多樣性分別為0.561 6、1.681 6和0.382 3。表明RAPD能較好地研究Vp的分子遺傳特征，適合于區分不同來源的Vp菌株。

關鍵詞海產品；副溶血弧菌；基因分型；RAPD；聚類分析；北部灣

中圖分類號Q789文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0273-02

ResearchonGenotypingofVibrioparahaemolyticusinSeafoodinPartofChineseBeibuGulf

WEI Qiang 1LI Yi-cai 2

（1 Luobu Town Yufeng District Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Station of Liuzhou City in Guangxi Zhuang Autonomous Region 545011；

2 Laibin Animal Product Quality and Safety Testing Center）

AbstractGenotyping 24 strains of Vp from Beibu Gulf were conducted using RAPD. The results showed that RAPD yielded 7 to 11 distinct bands with the size range between 0.45 kb and 1.50 kb. Cluster analysis showed that with the coefficient more than 0.84，RAPD resolution index was 0.931. Using POPGENE 32 software compared to the parameters of various genetic 24 strains of Vp，results showed that the Shannon information index（I），effective number of alleles per locus（Ne），Nei′s gene diversity index（H）of RAPD were 0.561 6，1.681 6 and 0.382 3，respectively. The results showed that the RAPD method was sensitive to distinguish reflect the molecular genetic characteristics Vp strains.

Key wordsseafood；Vibrio parahaemolyticus；genotype；RAPD；clustering analysis；Beibu Gulf

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）的傳統分型方法是血清分型，主要是利用菌體的O抗原和莢膜的K抗原對細菌進行區分。但是該方法也存在不少缺點：分辨力有限，且人為因素干擾嚴重，尤其在突發公共衛生事件需要病原進行溯源時難以滿足準確、快速追蹤的需求。隨著分子生物學技術的發展，基因分型技術已越來越廣泛的應用于病源微生物的檢測和流行病學的研究中。用分子分型技術從分子水平上研究Vp的變化情況，能更好地了解不同地區Vp之間的親緣關系以及遺傳關系變化情況，也有利于追蹤Vp感染的源頭，從而更好地預防和控制Vp引起的食物中毒等事件的發生[1]。

通過從我國北部灣4個海區不同采樣點采集的不同貝類樣品中分離的Vp，利用RAPD方法，分析了不同來源菌株間的種類、遺傳參數，比較了Vp菌株的指紋圖譜的相似度，以便了解不同地區貝類產品中不同菌株的遺傳變異程度和考察菌株間的差異和地理來源的關系。以此為基礎探討RAPD分型技術的優缺點，為深入了解Vp的分子生物學特征提供技術參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株來源。分別從我國北部灣湛江港、防城港，欽州港和北海港采集貝類樣品（牡蠣、扇貝、菲律賓蛤仔、毛蚶、貽貝、縊蟶），并分離菌株，采用MPN-PCR[2]方法檢測，確定為Vp菌株，共從中挑選出的24株，菌株的來源（表1）。

1.1.2試劑。TaqDNA聚合酶，10×Buffer，2.5 mmol/L dNTPs，DNA Maker，6×Loading Buffer購自TAKARA公司；Gene Finder核酸染料，購自廈門百維信生物科技有限公司；RAPD引物序列為：5′-CAGGCGCACA-3′，均由華大基因合成。

1.2試驗方法

1.2.1副溶血弧菌基因組DNA的提取。參照文獻[3]和《精編分子生物學實驗指南》的CTAB法提取副溶血弧菌分離株基因組DNA。

1.2.2RAPD反應體系及反應參數。RAPD的反應體系（表2），PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min，后45個循環每個循環包括（94 ℃變性，1 min，36 ℃連接1 min 30 s，72 ℃延伸2 min 30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴增產物與Gene Finder核酸染料混合后，經1.5%的瓊脂糖點樣，90 V電泳120 min，凝膠成像系統成像并拍照。

1.3數據處理

DNA指紋分析的結果是二元性狀的圖，即在同一位置上的帶屬于同一個位點，有帶的記為1，無帶的記為0。所得的位點按分子量從大到小排列。應用POPGENE 32軟件對28個個體進行遺傳參數計算。其中有：①反映基因多少和狀況的遺傳參數：觀測等位基因數（Na，Observed number of alleles）和有效等位基因數（Ne，Effective number of alleles）（Kimura and Crow，1964）；②反映基因多樣性信息的遺傳參數，Nei基因多樣性（H，Nei′s gene diversity）和Shannon信息指數（I，Shannon′s Information index，Lewontin 1972）。

數據用NTSYS pc2.10e軟件計算遺傳相似系數，并選定UPGMA（Unweighted pair group method using arithmetic average，非加權配對算術平均法）聚類方法，自動生成聚類圖。分辨力指數（D）按以下公式進行計算：

D=1-■■nj（nj-1）

其中N為樣本數，s為能區分的類型數，nj為屬于j類型的樣本數量。

2結果與分析

2.1RAPD電泳圖譜分析

電泳結果如圖1所示，表明RAPD擴增的條帶在450~1 500 bp，擴增的條帶為7~11條，條帶清晰明亮，多態性高。

2.2RAPD遺傳參數分析

POPGENE 32軟件對24株菌進行分析結果如表3所示，結果表明：Shannon信息指數（Ⅰ）為0.561 6，說明各個菌株間個體分配的均勻性差異較大；等位基因觀察數（Na）為2.000；有效等位基因數（Ne）為1.681 6；Nei′s基因多樣性指數（H）為0.382 3。Nei′s基因多樣性指數相對較高達到0.382 3，說明Vp群體間交流頻繁，產生了遺傳多樣性。

2.3RAPD聚類分析

根據RAPD電泳圖譜，用NTSYS pc2.10e軟件對24株菌的遺傳關系進行聚類分析（圖2）。從遺傳相似性系數可知，Vp種間相似性系數變化較大。聚類結果表明，在0.84相似度時，24株菌可分成16個群，分辨力指數為0.931。

3討論

3.1RAPD優缺點

RAPD技術由于操作簡便、試驗成本低，可以通過未知的DNA模板序列信息的條件下，采用幾個較短的隨機引物通過PCR擴增基因組DNA模板的任意部分，從而可以對整個群落進行描繪等獨特的優點倍受重視，并已被廣泛應用于生物遺傳多樣性的研究[4]。但是RAPD技術缺點表現在易受外界因素影響，重復性較差。而且由于RAPD對于由幾個相同堿基組成的序列不能區分出來，因此對物種的相似性估計有偏大的趨勢，這個是RAPD的最大不足之處。

3.2Vp分型方法比較

試驗中采用RAPD技術對24株Vp分型進行結果因此RAPD技術比較適合對大規模的Vp的分型研究。根據RAPD展現出Vp不同菌株間多態性，比較其遺傳相似度后發現：不同地點采集的Vp具有豐富的遺傳多樣性。有些表現出遺傳相似度較高，表明他們具有更近的親緣關系，同時也表明，菌株的遺傳相似性與地理位置、宿主等有一定的相關性。這個結論與蘇婷等[5]采用DGGE技術調查廣州南海海區Vp的多態性結果類似。

RAPD產生的條帶明亮、清晰，方法操作簡單，成本低廉，便于快速檢驗，因此就本次研究來說RAPD比較適合對Vp菌株進行分型。DGGE技術具有良好的分辨率，可以達到1個堿基差異的水平，因此要是RAPD能結合DGGE技術，就能各自發揮各自的優點。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技術研究4種大麥時，發現該技術組合能克服RAPD在應用于植物的遺傳分析試驗，例如低水平的重復性和多態性，同時具有高的結果重現性，更高水平的多態性，因此是一種相互結合的良好的DNA分析技術。

4參考文獻

[1] 鐘凱.副溶血弧菌的快速檢驗與應用[J].中國預防醫學雜志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.國內主要沿海城市零售貝類中副溶血性弧菌的定量風險評估[D].青島：中國海洋大學，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 張俊彥，梅玲玲，朱敏，等.301份海水產品副溶血性弧菌定量檢測分析[J].中國衛生檢驗雜志，2007，17（3）：509-510.

[5] 蘇婷，羅鵬.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA間區多態性DGGE分析[J].熱帶海洋學報，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.

2.1RAPD電泳圖譜分析

電泳結果如圖1所示，表明RAPD擴增的條帶在450~1 500 bp，擴增的條帶為7~11條，條帶清晰明亮，多態性高。

2.2RAPD遺傳參數分析

POPGENE 32軟件對24株菌進行分析結果如表3所示，結果表明：Shannon信息指數（Ⅰ）為0.561 6，說明各個菌株間個體分配的均勻性差異較大；等位基因觀察數（Na）為2.000；有效等位基因數（Ne）為1.681 6；Nei′s基因多樣性指數（H）為0.382 3。Nei′s基因多樣性指數相對較高達到0.382 3，說明Vp群體間交流頻繁，產生了遺傳多樣性。

2.3RAPD聚類分析

根據RAPD電泳圖譜，用NTSYS pc2.10e軟件對24株菌的遺傳關系進行聚類分析（圖2）。從遺傳相似性系數可知，Vp種間相似性系數變化較大。聚類結果表明，在0.84相似度時，24株菌可分成16個群，分辨力指數為0.931。

3討論

3.1RAPD優缺點

RAPD技術由于操作簡便、試驗成本低，可以通過未知的DNA模板序列信息的條件下，采用幾個較短的隨機引物通過PCR擴增基因組DNA模板的任意部分，從而可以對整個群落進行描繪等獨特的優點倍受重視，并已被廣泛應用于生物遺傳多樣性的研究[4]。但是RAPD技術缺點表現在易受外界因素影響，重復性較差。而且由于RAPD對于由幾個相同堿基組成的序列不能區分出來，因此對物種的相似性估計有偏大的趨勢，這個是RAPD的最大不足之處。

3.2Vp分型方法比較

試驗中采用RAPD技術對24株Vp分型進行結果因此RAPD技術比較適合對大規模的Vp的分型研究。根據RAPD展現出Vp不同菌株間多態性，比較其遺傳相似度后發現：不同地點采集的Vp具有豐富的遺傳多樣性。有些表現出遺傳相似度較高，表明他們具有更近的親緣關系，同時也表明，菌株的遺傳相似性與地理位置、宿主等有一定的相關性。這個結論與蘇婷等[5]采用DGGE技術調查廣州南海海區Vp的多態性結果類似。

RAPD產生的條帶明亮、清晰，方法操作簡單，成本低廉，便于快速檢驗，因此就本次研究來說RAPD比較適合對Vp菌株進行分型。DGGE技術具有良好的分辨率，可以達到1個堿基差異的水平，因此要是RAPD能結合DGGE技術，就能各自發揮各自的優點。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技術研究4種大麥時，發現該技術組合能克服RAPD在應用于植物的遺傳分析試驗，例如低水平的重復性和多態性，同時具有高的結果重現性，更高水平的多態性，因此是一種相互結合的良好的DNA分析技術。

4參考文獻

[1] 鐘凱.副溶血弧菌的快速檢驗與應用[J].中國預防醫學雜志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.國內主要沿海城市零售貝類中副溶血性弧菌的定量風險評估[D].青島：中國海洋大學，2010.

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[5] 蘇婷，羅鵬.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA間區多態性DGGE分析[J].熱帶海洋學報，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.

2.1RAPD電泳圖譜分析

電泳結果如圖1所示，表明RAPD擴增的條帶在450~1 500 bp，擴增的條帶為7~11條，條帶清晰明亮，多態性高。

2.2RAPD遺傳參數分析

POPGENE 32軟件對24株菌進行分析結果如表3所示，結果表明：Shannon信息指數（Ⅰ）為0.561 6，說明各個菌株間個體分配的均勻性差異較大；等位基因觀察數（Na）為2.000；有效等位基因數（Ne）為1.681 6；Nei′s基因多樣性指數（H）為0.382 3。Nei′s基因多樣性指數相對較高達到0.382 3，說明Vp群體間交流頻繁，產生了遺傳多樣性。

2.3RAPD聚類分析

根據RAPD電泳圖譜，用NTSYS pc2.10e軟件對24株菌的遺傳關系進行聚類分析（圖2）。從遺傳相似性系數可知，Vp種間相似性系數變化較大。聚類結果表明，在0.84相似度時，24株菌可分成16個群，分辨力指數為0.931。

3討論

3.1RAPD優缺點

RAPD技術由于操作簡便、試驗成本低，可以通過未知的DNA模板序列信息的條件下，采用幾個較短的隨機引物通過PCR擴增基因組DNA模板的任意部分，從而可以對整個群落進行描繪等獨特的優點倍受重視，并已被廣泛應用于生物遺傳多樣性的研究[4]。但是RAPD技術缺點表現在易受外界因素影響，重復性較差。而且由于RAPD對于由幾個相同堿基組成的序列不能區分出來，因此對物種的相似性估計有偏大的趨勢，這個是RAPD的最大不足之處。

3.2Vp分型方法比較

試驗中采用RAPD技術對24株Vp分型進行結果因此RAPD技術比較適合對大規模的Vp的分型研究。根據RAPD展現出Vp不同菌株間多態性，比較其遺傳相似度后發現：不同地點采集的Vp具有豐富的遺傳多樣性。有些表現出遺傳相似度較高，表明他們具有更近的親緣關系，同時也表明，菌株的遺傳相似性與地理位置、宿主等有一定的相關性。這個結論與蘇婷等[5]采用DGGE技術調查廣州南海海區Vp的多態性結果類似。

RAPD產生的條帶明亮、清晰，方法操作簡單，成本低廉，便于快速檢驗，因此就本次研究來說RAPD比較適合對Vp菌株進行分型。DGGE技術具有良好的分辨率，可以達到1個堿基差異的水平，因此要是RAPD能結合DGGE技術，就能各自發揮各自的優點。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技術研究4種大麥時，發現該技術組合能克服RAPD在應用于植物的遺傳分析試驗，例如低水平的重復性和多態性，同時具有高的結果重現性，更高水平的多態性，因此是一種相互結合的良好的DNA分析技術。

4參考文獻

[1] 鐘凱.副溶血弧菌的快速檢驗與應用[J].中國預防醫學雜志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.國內主要沿海城市零售貝類中副溶血性弧菌的定量風險評估[D].青島：中國海洋大學，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 張俊彥，梅玲玲，朱敏，等.301份海水產品副溶血性弧菌定量檢測分析[J].中國衛生檢驗雜志，2007，17（3）：509-510.

[5] 蘇婷，羅鵬.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA間區多態性DGGE分析[J].熱帶海洋學報，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.