綠原酸的提取與分離

汪玉秀，王俊儒，常君成，來冬梅，高錦明

摘要：根據現代分離技術課程的特點，選擇任課教師科研課題中與現代分離技術密切相關的內容：金銀花中綠原酸的提取與分離，將原本孤立的分離技術基礎實驗改為綜合性實驗，其內容涉及固體中有效成分的提取技術、減壓濃縮技術、紫外檢測技術以及硅膠吸附柱層析、硅膠吸附薄層層析和高效液相色譜等現代分離技術。使學生在系統地掌握實驗技能的同時，親身體驗了現代分離技術在天然產物研究中的重要作用。

關鍵詞：提取；分離；現代分離技術；實驗課程

中圖分類號：G642.0；Q946-33 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2014）06-0241-02

現代分離技術是西北農林科技大學應用化學專業的學科基礎課程，課程內容包括蒸餾、萃取、結晶、經典色譜、現代色譜等技術。過去我們采用4個實驗完成這些技術的操作練習，有些實驗技術重復，有些分離技術沒有接觸到，更主要的是這些分離技術是孤立完成的。為了讓學生系統地理解這些分離技術相互之間的關聯性，并為天然產物化學等專業課程奠定一定的基礎，現代分離技術實驗課程將原本孤立的基礎實驗改為綜合性實驗，選擇了任課教師科研課題中部分相關內容：金銀花中綠原酸的提取與分離，此實驗包括了現代分離技術課程中大部分技術內容。

一、金銀花與綠原酸

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬多種植物的干燥花蕾，它是一種“藥食同源”的綠色植物，是臨床常用的中藥之一。另外，金銀花還被廣泛地應用于保健品、化妝品、卷煙、食品等行業。近代研究一般認為金銀花的主要生物活性有效成分為綠原酸類化合物，并且常以綠原酸含量的高低來評價金銀花質量的優劣。綠原酸結構式表示如下：

二、實驗方案

金銀花中綠原酸的提取分離過程：將金銀花粉碎成粉末，然后用75%乙醇索氏提取，所得濾液減壓濃縮后60℃干燥得粗提物，將粗提物與硅膠1∶1拌樣，將拌好的混合樣上硅膠柱，用乙酸乙酯∶甲酸∶水不同比例進行洗脫得到綠原酸的洗脫液，將其濃縮至干，得到綠原酸粗品，再將粗品用硅膠柱分離，用氯仿∶甲醇混合溶液梯度洗脫得到綠原酸精品，最后用高效液相色儀譜檢測含量即可。

三、實驗方法及預作結果

1.提取過程。將金銀花制成粗粉，稱取約30g，以75%的乙醇為溶劑，采用索氏提取器提取4h，其提取液減壓濃縮后60℃干燥得浸膏。

2.分離過程。（1）粗分離。取一定量上述浸膏，按1∶1加入200～300目硅膠拌樣，晾干。用乙酸乙酯濕法裝柱（柱型？4.5cm×53cm，硅膠100～200目），干法上樣，柱體依次用乙酸乙酯（A）、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）（B）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶0.1）（C）、甲醇（D）洗脫。流速控制在每分鐘1/10柱體積即可。分部收集，每管30mL，其中（A）液洗脫收集4管，（B）液洗脫收集8管，（C）液洗脫收集12管，（D）液洗脫收集2管，共4個部分。薄層（TLC）檢測，結合顯色劑顯色，將相同餾分合并。（2）粗分離過程中TLC檢測。采用TLC對粗分離過程中柱子的洗脫情況進行跟蹤檢測，展開劑為乙酸丁酯∶甲酸∶水（7∶2.5∶2.5）。從某個餾分開始有綠原酸出現（365nm波長下顯蘭色熒光）至幾乎看不到蘭色熒光，表示綠原酸已基本收集完全。具體方法描述如下：①收集液的TLC預檢。在對各收集管進行TLC分析之前，為了節約薄板，可用毛細管將各收集管中的液體依次在一塊薄板上并對各點樣按照相應的管號一次編號，等樣點上的溶劑徹底揮發干后，置于波長365nm的紫外燈下觀察，有明顯斑點的表明其對應接受管中含有化合物，沒有斑點的表明對應管中沒有化合物。然后再對有斑點的各管進行TLC分析。②TLC分析。TLC分析的內容包括：第一，判斷斑點數的多少。展開后，斑點數多表明所含化合物越多。只有一個斑點者表明對應管中可能含有純化合物。斑點顏色越深表明所含對應化合物的量越多。第二，根據Rf值或斑點高度判斷不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有相同斑點，表明兩管含有相同的成分。B7到C10部分經TLC檢測含有大量的綠原酸，這些部分合并濃縮至干后得綠原酸粗品（E）。③精制。將綠原酸粗品再經硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，得單一化合物（F），即為綠原酸精品（0.85g）。

3.檢測。對E和F兩部分分別進行高效液相色譜分析。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～10μL，注入液相色譜儀，檢測兩部分的綠原酸含量。測定條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑以乙腈-0.4%磷酸（13：87）為流動相，SPD-10AV紫外檢測器λ327nm下檢測。E含綠原酸75%左右，F含綠原酸98%以上。

四、教改效果

上述實驗內容需要16學時，要求學生在兩天的時間內完成，期間許多操作技術交叉進行，大大提高了實驗效率，使學生在系統地掌握固體中有效成分的提取（索氏法）技術、減壓濃縮（旋轉蒸發）技術、紫外檢測技術以及硅膠吸附柱層析、硅膠吸附薄層層析和高效液相色譜現代分離技術實驗技能的同時，親身體驗了現代分離技術在天然產物研究中的重要作用，收到了預期的效果。

參考文獻：

[1]王俊儒，高錦明，張玉林，等.天然產物提取分離與鑒定技術[J].咸陽：西北農林科技大學出版社，2005，125-134.

[2]陸九芳，李總成，包鐵竹，等.分離過程化學[M].北京：清華大學出版社，1993：35-36，106-110，141-146.

[3]丁明玉.現代分離方法與技術[M].北京：化學工業出版社，2006：92-99，127-132，174-176.

[4]高素蓮，周寧國.現代分離純化與分析[M].北京：中國科學技術大學出版社，2004：15-16，42-43，121-123，130-131.

[5]盧艷花，魏東芝，蔣曉萌.中藥有效成分提取分離技術[M].北京：化學工業出版社，2008，10-13，22-39，123-124.

基金項目：陜西省教學改革重點攻關項目（11BG05），西北農林科技大學2011年校級教學改革研究項目（JY1101012，JY1102115）。

作者簡介：汪玉秀，女，副教授，主要研究方向：植物資源化學。endprint

摘要：根據現代分離技術課程的特點，選擇任課教師科研課題中與現代分離技術密切相關的內容：金銀花中綠原酸的提取與分離，將原本孤立的分離技術基礎實驗改為綜合性實驗，其內容涉及固體中有效成分的提取技術、減壓濃縮技術、紫外檢測技術以及硅膠吸附柱層析、硅膠吸附薄層層析和高效液相色譜等現代分離技術。使學生在系統地掌握實驗技能的同時，親身體驗了現代分離技術在天然產物研究中的重要作用。

關鍵詞：提取；分離；現代分離技術；實驗課程

中圖分類號：G642.0；Q946-33 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2014）06-0241-02

現代分離技術是西北農林科技大學應用化學專業的學科基礎課程，課程內容包括蒸餾、萃取、結晶、經典色譜、現代色譜等技術。過去我們采用4個實驗完成這些技術的操作練習，有些實驗技術重復，有些分離技術沒有接觸到，更主要的是這些分離技術是孤立完成的。為了讓學生系統地理解這些分離技術相互之間的關聯性，并為天然產物化學等專業課程奠定一定的基礎，現代分離技術實驗課程將原本孤立的基礎實驗改為綜合性實驗，選擇了任課教師科研課題中部分相關內容：金銀花中綠原酸的提取與分離，此實驗包括了現代分離技術課程中大部分技術內容。

一、金銀花與綠原酸

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬多種植物的干燥花蕾，它是一種“藥食同源”的綠色植物，是臨床常用的中藥之一。另外，金銀花還被廣泛地應用于保健品、化妝品、卷煙、食品等行業。近代研究一般認為金銀花的主要生物活性有效成分為綠原酸類化合物，并且常以綠原酸含量的高低來評價金銀花質量的優劣。綠原酸結構式表示如下：

二、實驗方案

金銀花中綠原酸的提取分離過程：將金銀花粉碎成粉末，然后用75%乙醇索氏提取，所得濾液減壓濃縮后60℃干燥得粗提物，將粗提物與硅膠1∶1拌樣，將拌好的混合樣上硅膠柱，用乙酸乙酯∶甲酸∶水不同比例進行洗脫得到綠原酸的洗脫液，將其濃縮至干，得到綠原酸粗品，再將粗品用硅膠柱分離，用氯仿∶甲醇混合溶液梯度洗脫得到綠原酸精品，最后用高效液相色儀譜檢測含量即可。

三、實驗方法及預作結果

1.提取過程。將金銀花制成粗粉，稱取約30g，以75%的乙醇為溶劑，采用索氏提取器提取4h，其提取液減壓濃縮后60℃干燥得浸膏。

2.分離過程。（1）粗分離。取一定量上述浸膏，按1∶1加入200～300目硅膠拌樣，晾干。用乙酸乙酯濕法裝柱（柱型？4.5cm×53cm，硅膠100～200目），干法上樣，柱體依次用乙酸乙酯（A）、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）（B）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶0.1）（C）、甲醇（D）洗脫。流速控制在每分鐘1/10柱體積即可。分部收集，每管30mL，其中（A）液洗脫收集4管，（B）液洗脫收集8管，（C）液洗脫收集12管，（D）液洗脫收集2管，共4個部分。薄層（TLC）檢測，結合顯色劑顯色，將相同餾分合并。（2）粗分離過程中TLC檢測。采用TLC對粗分離過程中柱子的洗脫情況進行跟蹤檢測，展開劑為乙酸丁酯∶甲酸∶水（7∶2.5∶2.5）。從某個餾分開始有綠原酸出現（365nm波長下顯蘭色熒光）至幾乎看不到蘭色熒光，表示綠原酸已基本收集完全。具體方法描述如下：①收集液的TLC預檢。在對各收集管進行TLC分析之前，為了節約薄板，可用毛細管將各收集管中的液體依次在一塊薄板上并對各點樣按照相應的管號一次編號，等樣點上的溶劑徹底揮發干后，置于波長365nm的紫外燈下觀察，有明顯斑點的表明其對應接受管中含有化合物，沒有斑點的表明對應管中沒有化合物。然后再對有斑點的各管進行TLC分析。②TLC分析。TLC分析的內容包括：第一，判斷斑點數的多少。展開后，斑點數多表明所含化合物越多。只有一個斑點者表明對應管中可能含有純化合物。斑點顏色越深表明所含對應化合物的量越多。第二，根據Rf值或斑點高度判斷不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有相同斑點，表明兩管含有相同的成分。B7到C10部分經TLC檢測含有大量的綠原酸，這些部分合并濃縮至干后得綠原酸粗品（E）。③精制。將綠原酸粗品再經硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，得單一化合物（F），即為綠原酸精品（0.85g）。

3.檢測。對E和F兩部分分別進行高效液相色譜分析。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～10μL，注入液相色譜儀，檢測兩部分的綠原酸含量。測定條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑以乙腈-0.4%磷酸（13：87）為流動相，SPD-10AV紫外檢測器λ327nm下檢測。E含綠原酸75%左右，F含綠原酸98%以上。

四、教改效果

上述實驗內容需要16學時，要求學生在兩天的時間內完成，期間許多操作技術交叉進行，大大提高了實驗效率，使學生在系統地掌握固體中有效成分的提取（索氏法）技術、減壓濃縮（旋轉蒸發）技術、紫外檢測技術以及硅膠吸附柱層析、硅膠吸附薄層層析和高效液相色譜現代分離技術實驗技能的同時，親身體驗了現代分離技術在天然產物研究中的重要作用，收到了預期的效果。

參考文獻：

[1]王俊儒，高錦明，張玉林，等.天然產物提取分離與鑒定技術[J].咸陽：西北農林科技大學出版社，2005，125-134.

[2]陸九芳，李總成，包鐵竹，等.分離過程化學[M].北京：清華大學出版社，1993：35-36，106-110，141-146.

[3]丁明玉.現代分離方法與技術[M].北京：化學工業出版社，2006：92-99，127-132，174-176.

[4]高素蓮，周寧國.現代分離純化與分析[M].北京：中國科學技術大學出版社，2004：15-16，42-43，121-123，130-131.

[5]盧艷花，魏東芝，蔣曉萌.中藥有效成分提取分離技術[M].北京：化學工業出版社，2008，10-13，22-39，123-124.

基金項目：陜西省教學改革重點攻關項目（11BG05），西北農林科技大學2011年校級教學改革研究項目（JY1101012，JY1102115）。

作者簡介：汪玉秀，女，副教授，主要研究方向：植物資源化學。endprint

摘要：根據現代分離技術課程的特點，選擇任課教師科研課題中與現代分離技術密切相關的內容：金銀花中綠原酸的提取與分離，將原本孤立的分離技術基礎實驗改為綜合性實驗，其內容涉及固體中有效成分的提取技術、減壓濃縮技術、紫外檢測技術以及硅膠吸附柱層析、硅膠吸附薄層層析和高效液相色譜等現代分離技術。使學生在系統地掌握實驗技能的同時，親身體驗了現代分離技術在天然產物研究中的重要作用。

關鍵詞：提取；分離；現代分離技術；實驗課程

中圖分類號：G642.0；Q946-33 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2014）06-0241-02

現代分離技術是西北農林科技大學應用化學專業的學科基礎課程，課程內容包括蒸餾、萃取、結晶、經典色譜、現代色譜等技術。過去我們采用4個實驗完成這些技術的操作練習，有些實驗技術重復，有些分離技術沒有接觸到，更主要的是這些分離技術是孤立完成的。為了讓學生系統地理解這些分離技術相互之間的關聯性，并為天然產物化學等專業課程奠定一定的基礎，現代分離技術實驗課程將原本孤立的基礎實驗改為綜合性實驗，選擇了任課教師科研課題中部分相關內容：金銀花中綠原酸的提取與分離，此實驗包括了現代分離技術課程中大部分技術內容。

一、金銀花與綠原酸

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬多種植物的干燥花蕾，它是一種“藥食同源”的綠色植物，是臨床常用的中藥之一。另外，金銀花還被廣泛地應用于保健品、化妝品、卷煙、食品等行業。近代研究一般認為金銀花的主要生物活性有效成分為綠原酸類化合物，并且常以綠原酸含量的高低來評價金銀花質量的優劣。綠原酸結構式表示如下：

二、實驗方案

金銀花中綠原酸的提取分離過程：將金銀花粉碎成粉末，然后用75%乙醇索氏提取，所得濾液減壓濃縮后60℃干燥得粗提物，將粗提物與硅膠1∶1拌樣，將拌好的混合樣上硅膠柱，用乙酸乙酯∶甲酸∶水不同比例進行洗脫得到綠原酸的洗脫液，將其濃縮至干，得到綠原酸粗品，再將粗品用硅膠柱分離，用氯仿∶甲醇混合溶液梯度洗脫得到綠原酸精品，最后用高效液相色儀譜檢測含量即可。

三、實驗方法及預作結果

1.提取過程。將金銀花制成粗粉，稱取約30g，以75%的乙醇為溶劑，采用索氏提取器提取4h，其提取液減壓濃縮后60℃干燥得浸膏。

2.分離過程。（1）粗分離。取一定量上述浸膏，按1∶1加入200～300目硅膠拌樣，晾干。用乙酸乙酯濕法裝柱（柱型？4.5cm×53cm，硅膠100～200目），干法上樣，柱體依次用乙酸乙酯（A）、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）（B）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶0.1）（C）、甲醇（D）洗脫。流速控制在每分鐘1/10柱體積即可。分部收集，每管30mL，其中（A）液洗脫收集4管，（B）液洗脫收集8管，（C）液洗脫收集12管，（D）液洗脫收集2管，共4個部分。薄層（TLC）檢測，結合顯色劑顯色，將相同餾分合并。（2）粗分離過程中TLC檢測。采用TLC對粗分離過程中柱子的洗脫情況進行跟蹤檢測，展開劑為乙酸丁酯∶甲酸∶水（7∶2.5∶2.5）。從某個餾分開始有綠原酸出現（365nm波長下顯蘭色熒光）至幾乎看不到蘭色熒光，表示綠原酸已基本收集完全。具體方法描述如下：①收集液的TLC預檢。在對各收集管進行TLC分析之前，為了節約薄板，可用毛細管將各收集管中的液體依次在一塊薄板上并對各點樣按照相應的管號一次編號，等樣點上的溶劑徹底揮發干后，置于波長365nm的紫外燈下觀察，有明顯斑點的表明其對應接受管中含有化合物，沒有斑點的表明對應管中沒有化合物。然后再對有斑點的各管進行TLC分析。②TLC分析。TLC分析的內容包括：第一，判斷斑點數的多少。展開后，斑點數多表明所含化合物越多。只有一個斑點者表明對應管中可能含有純化合物。斑點顏色越深表明所含對應化合物的量越多。第二，根據Rf值或斑點高度判斷不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有相同斑點，表明兩管含有相同的成分。B7到C10部分經TLC檢測含有大量的綠原酸，這些部分合并濃縮至干后得綠原酸粗品（E）。③精制。將綠原酸粗品再經硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，得單一化合物（F），即為綠原酸精品（0.85g）。

3.檢測。對E和F兩部分分別進行高效液相色譜分析。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～10μL，注入液相色譜儀，檢測兩部分的綠原酸含量。測定條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑以乙腈-0.4%磷酸（13：87）為流動相，SPD-10AV紫外檢測器λ327nm下檢測。E含綠原酸75%左右，F含綠原酸98%以上。

四、教改效果

上述實驗內容需要16學時，要求學生在兩天的時間內完成，期間許多操作技術交叉進行，大大提高了實驗效率，使學生在系統地掌握固體中有效成分的提取（索氏法）技術、減壓濃縮（旋轉蒸發）技術、紫外檢測技術以及硅膠吸附柱層析、硅膠吸附薄層層析和高效液相色譜現代分離技術實驗技能的同時，親身體驗了現代分離技術在天然產物研究中的重要作用，收到了預期的效果。

參考文獻：

[1]王俊儒，高錦明，張玉林，等.天然產物提取分離與鑒定技術[J].咸陽：西北農林科技大學出版社，2005，125-134.

[2]陸九芳，李總成，包鐵竹，等.分離過程化學[M].北京：清華大學出版社，1993：35-36，106-110，141-146.

[3]丁明玉.現代分離方法與技術[M].北京：化學工業出版社，2006：92-99，127-132，174-176.

[4]高素蓮，周寧國.現代分離純化與分析[M].北京：中國科學技術大學出版社，2004：15-16，42-43，121-123，130-131.

[5]盧艷花，魏東芝，蔣曉萌.中藥有效成分提取分離技術[M].北京：化學工業出版社，2008，10-13，22-39，123-124.

基金項目：陜西省教學改革重點攻關項目（11BG05），西北農林科技大學2011年校級教學改革研究項目（JY1101012，JY1102115）。

作者簡介：汪玉秀，女，副教授，主要研究方向：植物資源化學。endprint