液相色譜串聯質譜負離子模式數據庫的構建及對水產品中多種獸藥的篩查檢測

金 雁, 劉 瑜, 李曉東, 趙 穎, 蔣 施, 鐘 鈺, 鄭 晨

(1. 沈陽出入境檢驗檢疫局, 沈陽 110016;2. 上海愛博才思分析儀器貿易有限公司, 上海 200233)

金 雁1, 劉 瑜1, 李曉東1, 趙 穎1, 蔣 施1, 鐘 鈺1, 鄭 晨2

(1. 沈陽出入境檢驗檢疫局, 沈陽 110016;2. 上海愛博才思分析儀器貿易有限公司, 上海 200233)

建立水產品中獸藥的液相色譜-串聯質譜復合線性離子阱系統EPI掃描方式的數據庫及篩查分析方法。7種獸藥的最低檢出限(LOD,S/N≥3)5 μg/kg,最低定量限(LOQ,S/N≥10)10 μg/kg。每種獸藥添加10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3個水平到空白基質中(n=6),回收率為83.2%～105.8%,相對標準偏差(RSD)為4.9%～10.2%。方法除兩對離子對、保留時間外,利用子離子比對進行化合物的真偽鑒定,可以有效的排除假陽性。數據庫建立過程簡單快捷,借助離子阱的富集功能,實現對水產品樣本中多種獸藥殘留的定性定量分析,且具有靈敏、準確的特點。

液相色譜-串聯質譜復合線性離子阱; 數據庫; 獸藥篩查; 水產品

0 引 言

我國是水產品的養殖大國和出口大國,為了防治水生動物疾病、增加運輸過程中的成活率、促進生長、提高經濟效益,各類獸藥被廣泛應用于水產養殖中。但由于獸藥在使用過程中存在濫用、誤用及不遵守休藥期等現象,其副作用體現的越來越明顯,集中表現在以下幾個方面:1)耐藥菌株的產生;2)在水產品中產生藥物殘留;3)破壞微生態平衡;4)對免疫系統有抑制作用。其中因為在生物鏈頂端的人類長期食用藥物殘留的水產品將會產生耐藥性甚至導致多種疾病,所以在水產品中產生的藥物殘留最為引起人們的關注。許多國家及國際組織對水產品中的獸藥殘留制定了最大允許殘留限量( MRLs)[1-3],以保證水產品的安全衛生,進而維護水產品的食用安全。

目前,監控多種獸藥的方法有很多種,如微生物檢測法[4-5],液相色譜法[6],氣相色譜法[7],分子印跡膜法[8],氣相色譜質譜法[9],液相色譜質譜法[10-13],其中以液相色譜質譜法最為常見。氯霉素、氟苯尼考以及糖皮質激素類藥物均有可供參考的國家標準[14-16],雖然有很多研究報告發表[17-18],但是由于水產品樣本容易出現假陽性的特點,并且沒有專門針對多種負離子化合物的實驗方法。本研究應用液相色譜-三重四極桿/線性離子阱串聯質譜法(QTrap LC-MS/MS)檢測,具有從多級反應監測( MRM)→信息相關采集( IDA)→增強子離子掃描( EPI)→譜庫檢索的獨有檢測模式,開發針對負離子化合物數據庫的構建方法。通過構建這些化合物的標準譜庫,利用與標準譜庫對比的方法鑒定陽性樣品,提高方法的準確性。本研究針對水產品養殖中常用的抗生素及激素類藥物,建立了氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松的LC-MS/MS譜庫,并利用譜庫檢索建立水產品中7種藥物的快速LC-MS/MS篩查方法。該方法對保障我國水產品的質量安全具有重要意義。

1 實驗部分

1.1儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司);AB Sciex Qtrap 5500三重四極桿-線性加速離子阱復合質譜儀(美國AB公司);Millipore-Elix-QE-QG超純水機(美國Millipore公司);離心機(美國Thermo公司);MG-2200氮吹儀(美國EYELA公司);CPA 225D分析天平(德國Sartorius公司)等實驗室常用設備。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松標準品,購于Dr.Ehrenstorfer 公司;乙腈、甲醇為色譜純,水為超純水;冰醋酸、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純;C18( 天津Bonna-Agela 公司) 。標準品用少量乙腈溶解,色譜純乙腈定容配制1 mg/mL 標準儲備液,再根據需要稀釋成適當含量的標準工作液,4 ℃下保存,有效期為2 個月。

1.2色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×100 mm,粒徑1.7 μm),柱溫40 ℃,進樣量5 μL,流速0.3 mL/min。流動相A為超純水,B相為乙腈。起始B相為5%乙腈,1 min～10 min B相梯度變化到40%,10 min～15 min B相梯度變化為95%,15 min～18 min B相維持95%,18 min～18.1 min B相梯度變化為5%,保持5 min。

1.3質譜條件

離子源:ESI-;噴霧電壓(IS)-4 500 V,霧化氣(GS1)50 mL/min,氣簾氣(CUR)30 mL/min,輔助加熱氣(GS2)60 L/min,離子源溫度(TEM)600 ℃,碰撞氣5 mL/min,4 種氣體均為氮氣;Q1和Q3均為單位分辨率;ESI模式、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表1。

表1 7種化合物的最佳質譜參數

1.4數據庫構建

本實驗中一共建立了2個數據庫,一個是以化合物質譜圖為檢索信息的譜圖數據庫,一個是基于化合物保留時間的文本數據庫。數據采集時,以氟苯尼考為例,濃度10 ng/mL,保留時間6.4 min,保留時間窗口60 s。其中譜圖數據庫的建立過程是分別設定20、35、50 eV的碰撞能量以及CE為35 eV,CES為15 eV的擴展能量,采集這4張質譜圖用于化合物的匹配。對7種藥物氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松進行EPI掃描,并編寫7種藥物的液相色譜串聯質譜數據庫,包括分子式、分子量、CAS編號、化學名、結構圖等信息。另一個基于化合物保留時間的數據庫,包括化合物的保留時間、準分子離子峰、特征碎片離子峰、碰撞能量等質譜參數。實驗過程中,利用保留時間在文本數據庫中的信息編寫MRM采集方法,隨后設定IDA條件,當色譜峰滿足信號強度條件時將激發EPI掃描。

1.5樣品處理

稱取5.0 g水產品肉糜于100 mL離心管中,精確至0.01 g,加入20 mL 5% 醋酸乙腈提取液,同時加入2.0 g氯化鈉和8.0 g無水硫酸鈉均質提取1 min, 4 500 r/min 離心5 min,將上清液移入50 mL含750 mg C18分散劑的具塞離心管中,加入5 mL乙腈,水平振蕩5 min,使吸附劑和提取液充分接觸,以4 500 r/min離心5 min,靜置10 min沉淀蛋白后,取5 mL上清液(相當于1.0 g樣品)于10 mL試管中,40 ℃下氮吹濃縮至干。加入1 mL甲醇-水(1∶4)的定容液,經超聲溶解和渦旋混勻后,過0.22 μm濾膜,供LC-MS/MS測定。

1.6檢測模式

實驗過程中,利用基于化合物保留時間的數據庫找出所需監測化合物的MRM以及保留時間等數據信息,編輯MRM掃描方式,設定IDA→EPI實驗條件,這里所有監測化合物均以CE為35 eV,CES為15 eV的擴展能量的碰撞能量記錄MS/MS質譜數據,以便與數據庫進行對比,實驗中MRM→IDA→EPI的運行邏輯見圖1。

步驟1 MRM探測掃描；步驟2 系統自動判斷：探測掃描采集到的MRM信號強度超過預設值；步驟3 當步驟2的條件滿足時，系統IDA自動切換(<1ms)為線性離子阱模式，進行增強子離子掃描(EPI)，獲得探測掃描所得之母離子的高質量MS2譜圖；否則返回步驟1，運行MRM掃描。

圖1 MRM→IDA→EPI的運行邏輯圖

2 結果與討論

2.1質譜參數

通過優化離子源參數,得到7種化合物的最佳質譜參數見表1。

2.2實驗結果

采用2.1中質譜參數,得到其中化合物標準溶液濃度為10 ng/mL的MRM總離子流圖(見圖2)。

圖2 7種化合物的MRM總離子流圖

2.3數據庫的構建

以氟苯尼考為例,同時采集空白基質添加標準品濃度為10 ng/mL的MRM和EPI數據,分別得到MRM總離子流圖和富集的二級子離子全掃描質譜圖。記錄氟苯尼考的MRM色譜峰保留時間,以及在軟件上添加富集的二級子離子全掃描EPI質譜圖,同時用于化合物的鑒定。圖3中展示監控氟苯尼考得到的導航圖。其中圖3a為總離子流圖,圖3b為MRM的質譜圖、圖3c為MRM的色譜圖,圖3d為對應圖3c中的全掃描質譜圖。

選擇圖3d,點擊鼠標右鍵,添加氟苯尼考的二級質譜圖(Add a record,見圖4),同時補充化合物名稱、分子式、CAS號等相關信息,即可完成譜庫的添加。按此方法得到氯霉素、甲砜霉素、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松6種藥物的數據庫信息。

圖3 氟苯尼考導航圖

圖4 添加二級質譜圖

2.4數據庫的應用

實際掃描過程中,一旦某MRM通道采集的信號強度超過預設值后,即觸發EPI增強子離子掃描模式,進而獲得對應MRM通道的母離子的增強二級子離子全掃描質譜圖,該EPI譜庫可進行定性檢索,得到相應的匹配度。匹配度的大小用以確證目標化合物的真偽,從而實現定性功能;與此同時,MRM通道采集的信號依然可以作為定量分析的數據,能夠實現對目標化合物的同時定性定量分析,大大提高了工作效率。

2.5陽性樣品鑒定

實驗中,由于色譜分離的局限性,不能確定在保留時間誤差范圍內出現的色譜峰為氟苯尼考,此時需要借助EPI數據庫分析色譜峰。將未知樣品采集進行EPI數據譜庫檢索,軟件自動給出匹配值(正匹配值/反匹配值)用于色譜峰鑒定見圖5。

將樣品的EPI譜圖與空白基質標準品加標建立的EPI譜庫中譜圖進行比較,通過比較二級質譜圖,未知樣品EPI質譜圖(圖5a)與氟苯尼考標準溶液EPI質譜圖(圖5b)極為相似,與芐哌丁苯(圖5c)相差甚遠。并且得到它們的匹配結果(圖5d),其中Fit值( 匹配值)是用標準物質譜圖與可疑樣品譜圖進行對比后獲得的相似度值,滿分為100,Fit值越大可信度越高說明該化合物的可能性越大;Revfit值(反相匹配值)是用可疑樣品譜圖與標準物質譜圖進行對比后獲得的相似度值;Purity 值(純度值)是綜合前兩種結果得出的數值。檢索結果按Purity值從大到小排序,從表中可明顯得出可疑陽性樣品中氟苯尼考陽性的結論。

圖5 氟苯尼考陽性樣品確證

2.6精密度與檢測限

取處理好的水產品提取液注入QTrap系統中,采集5 ng/mL基質加標時得出信噪比分別為:氯霉素≥36、甲砜霉素≥23、氟苯尼考≥30、己烯雌酚≥23、雙烯雌酚≥4、雌酮≥12、地塞米松≥221。按照S/N≥3為方法的檢測限,出于簡便和實際意義角度考慮,將7種負離子的檢出限統一定為5 μg/kg。按照同樣方法,S/N≥10為方法的定量限為10 μg/kg。

配制10～5 000 ng/mL的系列混合標準溶液,采集數據并繪制標準曲線,得到7種化合物的線性相關系數R為0.993 6～0.999 9,線性良好。每種獸藥添加10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3個水平到空白基質中,每個水平重復6次,得到回收率為83.2%～105.8%,相對標準偏差(RSD)為4.9%～10.2%,完全滿足日常實驗室檢測的重現性要求。

2.7實際樣品測試

購市售水產品按照1.5步驟處理,經液相色譜質譜測試,通過空白基質添加的方式驗證方法的準確性。檢驗15種水產品中均未檢出陽性樣品。

3 結論

日常工作中,由于檢測樣品基質比較復雜,檢驗過程中常出現大量假陽性的情況。針對該狀況采用QTrap質譜特有的MRM→IDA→EPI掃描,實現一次進樣定性定量,大大簡化檢驗流程,增強檢測結果信心,有效確認化合物真偽。數據庫建立過程,簡單快捷,可實現一次進樣得到樣本的定量和定性數據,極大地提高工作效率。此外,實驗證明由于QTrap系統的富集功能,能夠實現即使在低濃度條件下,依然可以得到化合物高質量的二級質譜圖,對于限量較低的藥物的篩查確證非常實用。

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Developmentofveterinarydrugsdatalibraryandscreeningmethodofnegativemodebyliquidchromatography-tandemmassspectrometryinaquaticproducts

JINYan1,LIUYu1,LIXiaodong1,ZHAOYing1,JIANGShi1,ZHONGYu1,ZHENGChen2

(1. Shenyang Enter-exit Inspection and Quarantine Bureau of the P.R.China, Shenyang 110016, China; 2. AB SCIEX Asia Pacific Application Support Center, Shanghai 200233, China)

A liquid chromatography tandem triple-quadrupole linear ion trap mass spectrometric (QTrap LC-MS/MS) EPI mode was developed for the data library and simultaneous screening of veterinary drugs residual in aquatic products. The results showed that the limits of detection (LOD, S/N≥3) were 5 μg/kg and the limits of quantity(LOQ, S/N≥10) was 10 μg/kg for the veterinary drugs. The average recoveries (n=6) of the veterinary drugs in aquatic product samples at three levels 10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg were from 83.2% to 105.8% with the relative standard deviations (RSD) between 4.9% and 10.2%. Besides using two transitions and retention time, product ions were matched with the data libraries to identification the compounds. This process is proved to exclude the false positive samples effectively. The setting of the data library is quick and easy, and the ion-trap will help to apply the qualitative and quantitative determination of veterinary drugs in aquatic products with sensitive and accurate characteristics.

QTrap LC-MS/MS; data Library; veterinary drug screening; aquatic products

2014-04-26。

國家質檢總局科技計劃項目(2011IK215,2014IK129); “十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAK10B04-9); 遼寧出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(LK33-2007)。

金 雁(1974-),女,遼寧沈陽人,沈陽出入境檢驗檢疫局高級工程師,碩士。

1673-5862(2014)04-0496-06

O661.1

: A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2014.04.009