白細胞介素－17在病毒性心肌炎中的表達及黃芪甲甙干預對其的影響＊

劉海英，劉丹莉，高順利

（南華大學附屬第一醫院兒科，湖南衡陽 421001）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）等嗜心肌病毒引起的心肌炎癥性疾病，近年來發病率呈上升趨勢［1］。眾多臨床及動物實驗證實細胞因子在VMC的發病機制中起重要作用。白細胞介素－17（interleukin－17，IL－17）是一種由 Th17細胞分泌的前炎癥細胞因子，可誘導IL－6和腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）產生，具有強大的促炎作用［2］。已有研究發現，IL－17有助于VMC與自身免疫性心肌炎的發生、發展［3－4］。黃芪甲甙是從中藥黃芪中提取的一單體成分，對VMC有較好的治療效果［5］，然而，其抗VMC機制仍未完全闡明。為此，本研究通過CVB3感染Balb／c小鼠建立VMC動物模型，采用熒光實時定量PCR、免疫組化觀察IL－17在VMC小鼠心肌組織中的表達情況，并以黃芪甲甙進行干預研究，從而探索IL－17在VMC

發病機制中的作用及黃芪甲甙的干預效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 本實驗使用CVB3為Nancy株，由復旦大學附屬中山醫院衛生部病毒性心臟病重點實驗室提供，在Hela細胞中進行傳代，然后離心，提取上清液，并檢測50% 組織感染率（TCID50），TCID50為107，保存于－70℃冰箱備用，實驗所用病毒劑量為1×102TCID50。

1.1.2 動物 Balb／c小鼠60只，4周齡，雄性，純種，體質量12～16g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養于無特定病原體2000B017（SPF）條件下。

1.1.3 藥物 黃芪甲甙粉劑（批號：0781－9706）購買于國家藥物和生物制品檢定研究所（NICPBP），不溶于水，用助溶劑羧甲基纖維素鈉制成均勻懸液，根據預實驗將濃度設置為0.01、0.09g／L。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、模型制備及藥物干預 60只Balb／c小鼠按隨機數字表法分為4組：對照組、模型組、低劑量干預組以及高劑量干預組，每組15只。對照組小鼠僅腹腔注射0.1mL不含CVB3的病毒培養液，其余3組小鼠腹腔接種0.1mL內含1×102TCID50CVB3的病毒液，以誘發VMC，對照組和模型組于接種當日即用0.1mL羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，低劑量干預組和高劑量干預組分別以0.01、0.09g／L黃芪甲甙0.1 mL灌胃，每天灌胃1次，連續14d，并記錄各組小鼠一般狀況及每天存活數。第15天稱體質量（BW）后斷頸處死小鼠，摘取心臟，稱心臟質量（HW），計算HW／BW，然后將小鼠心臟沿左心室中線切為兩部分，一部分用甲醛固定、石碏包埋，用HE染色和免疫組化檢測；另一部分迅速置于液氮中，再轉移至－70℃冰箱凍存，用于總RNA的提取與ELISA檢測。

1.2.2 HE染色 按常規方法進行HE染色，在200倍光鏡下分析小鼠心肌病理學變化，參照文獻［6］計算心肌病變（炎癥浸潤或壞死）積分：每張心肌切片隨機選擇5個高倍視野，計算每個視野中炎癥細胞浸潤或壞死區域面積與整個視野面積比值，0分表示無病理學改變，1分表示心肌病變面積小于25%，2分表示心肌病變面積為25%～50%，3分表示心肌病變面積大于50%～75%，4分表示心肌病變面積大于75%。

1.2.3 熒光實時定量PCR檢測 采用美國Invitrogen公司生產的Trizol試劑提取小鼠心肌組織總RNA，溶于無Rnase水中，紫外分光光度計測定OD260／OD280的比值為1.8～2.0。取總RNA 2μg，用Fermentas公司逆轉錄試劑盒合成cDNA。按照文獻［7］由上海生工生物技術有限公司合成引物序列。IL－17上游引物：5′－GTC AAT GCG GAG GGA AAG－3′，下游引物：5′－CAC GAA GCA GTT TGG GAC－3′，擴增產物長度349bp；β－actin上游引物：5′－CCA GCC TTC CTT CTT GGG TAT－3′，下游引物：5′－TTG GCA TAG AGG TCT TTA CGG－3′，擴增產物長度102bp。取10μL逆轉錄產物進行PCR反應，反應條件：94℃預變性3min，94℃變性45s，58℃復性30 s，72℃延伸45s，總共35個循環，72℃延伸10min。溶解曲線分析表明PCR反應產物為單獨的雙鏈DNA。用ΔΔCt值法，以β－actin表達為內參定量IL－17的表達。

1.2.4 Western blot檢測 將心肌組織放入液氮碾磨，三去污裂解液裂解。利用BCA蛋白定量測定試劑盒（Hyclone－Pierce公司）檢測蛋白水平，50μg蛋白與加樣緩沖液混合，在10%不連續十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中電泳分離，電轉移至PVDF膜，孵育一抗（美國Santa Cruz公司）、二抗，以β－actin為內參照，用ECL發光法顯色，曝光、顯影、定影。膠片條帶用薄層掃描儀進行掃描后，運用Imager2200軟件分析各產物積分光密度值，計算IL－17蛋白表達水平。IL－17蛋白表達水平＝IL－17積分光密度值／β－actin積分光密度值。

1.2.5 ELISA檢測 通過苯甲磺酰基氟化物（PMSF）將心肌組織勻漿，然后離心，提取上清液，利用ELISA試劑盒（深圳晶美生物工程公司）檢測上清液中IL－6、TNF－α水平，嚴格按照說明書由專人進行操作。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，多組均數比較行單因素方差分析及兩兩之間比較的q檢驗，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 黃芪甲甙對小鼠死亡率與HW／BW的影響 在實驗期間，對照組無小鼠死亡，模型組死亡率為46.67%（7／15），低劑量干預組死亡率為33.33%（5／15），高劑量干預組死亡率為20.00%（3／15）；高劑量干預組死亡率較模型組降低（P＜0.05），但低劑量干預組死亡率與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組 HW／BW 明顯增加（P＜0.01）；經黃芪甲甙處理后，高劑量干預組HW／BW較模型組降低（P＜0.05），然而低劑量黃芪甲甙對HW／BW無影響（P＞0.05），見表1。

2.2 黃芪甲甙對心肌病理組織學變化的影響 對照組心肌呈規則排列，未見到炎癥細胞浸潤和心肌細胞壞死；模型組出現大片心肌細胞壞死，周圍可見眾多炎癥細胞浸潤；低劑量干預組心肌病變程度與模型組相似；高劑量干預組壞死灶和炎性細胞浸潤明顯減少。與模型組比較，高劑量干預組炎癥細胞浸潤與心肌壞死積分顯著降低（P＜0.01）；而低劑量干預組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1、表1。

圖1 各組心肌病理學改變（×200）

表1 各組死亡率、HW／BW及病理積分比較

2.3 黃芪甲甙對心肌IL－17mRNA表達的影響 條帶密度掃描及半定量分析顯示，模型組心肌組織中IL－17mRNA表達水平較對照組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，經過高劑量黃芪甲甙處理后，其表達水平明顯降低（P＜0.05）；低劑量干預組IL－17mRNA表達水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.4 黃芪甲甙對心肌IL－17蛋白表達的影響 Western blot檢測顯示，模型組IL－17蛋白表達水平較對照組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，經過高劑量黃芪甲甙處理后，IL－17蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），但低劑量黃芪甲甙對其無明顯影響（P＞0.05），見圖3。

圖2 各組小鼠心肌IL－17mRNA表達比較

圖3 各組小鼠心肌IL－17蛋白表達比較

2.5 黃芪甲甙對心肌組織IL－6、TNF－α水平的影響 ELISA檢測結果顯示，模型組心肌組織中IL－6、TNF－α水平顯著高于對照組（P＜0.01）；經高劑量黃芪甲甙處理后，IL－6、TNF－α水平較模型組明顯降低（P＜0.05），但低劑量黃芪甲甙對上述指標無影響（P＞0.05），見圖4、5。

圖4 各組小鼠心肌IL－6水平比較

圖5 各組小鼠心肌TNF－α水平比較

3 討 論

IL－17是Th17細胞分泌的特征性因子，由155個氨基酸組成，相對分子質量為3×103，N端為19～23個氨基酸殘基組成的信號多肽，其基因定位于染色體2q31。近年研究發現，IL－17是一種強大的前炎癥因子，可誘導中性粒細胞的發育和成熟，并能刺激T細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、上皮細胞分泌多種炎癥介質，如IL－1、IL－6、IL－8、TNF－α、一氧化氮合酶2、單核細胞趨化蛋白－1、生長調節因子α、金屬蛋白酶及化學增活素等，從而誘導炎癥反應［8］。Yuan等［9］報道，Th17細胞及血清IL－17水平在急性VMC患者中升高。Chang等［10］在心肌肌球蛋白誘導的實驗性自身免疫性心肌炎中發現，心臟組織中IL－17、IL－17受體、IL－23表達均增加，其中以IL－17增加最為明顯。有研究表明，IL－17在VMC小鼠心肌組織中表達顯著升高，并且與心肌病變程度呈正相關［7］。本研究結果顯示，在正常小鼠心肌組織中存在低水平的IL－17表達，當小鼠感染CVB3后，IL－17的表達量顯著升高，與文獻［7］報道一致，表明在生理條件下組成性表達的IL－17可能參與維持心臟結構與功能的平衡，而CVB3感染所致的IL－17過表達可能與VMC的發生、進發展密切相關。因此，抑制IL－17的表達及其介導的炎癥反應可能成為治療VMC的一個潛在的、有價值的靶點。

黃芪為一傳統中藥，具有補氣升陽、益衛固表、利尿消腫、托毒生肌、益氣理虛、伏正固本之功效。黃芪甲甙是黃芪注射液中的主要有效成分，它是一種黃芪皂甙類單體成分。眾多實驗不但發現其對實驗性VMC動物模型療效較好，而且已初步闡明其機制：抗病毒作用；抗心肌細胞凋亡作用［11］；下調心肌柯薩奇－腺病毒受體表達，從而減少CVB3對心肌細胞的親和力［12］；抑制心肌細胞L型鈣通道電流及鈣超載［10］。然而，這種藥物抗VMC的機制仍未完全闡明。本研究中，VMC小鼠給予高劑量黃芪甲甙干預治療后，小鼠死亡率、HW／BW、炎癥細胞浸潤與心肌壞死病理積分降低，IL－17mRNA和蛋白表達水平顯著下調，而低劑量黃芪甲甙干預治療則無此作用，提示黃芪甲甙對VMC有良好的治療作用，其機制可能與抑制IL－17表達有關。

炎癥因子IL－6、TNF－α過表達在VMC的發生、發展中起重要作用。已有研究證實IL－17能促進IL－6、TNF－α分泌。Yang等［13］報道，腹腔注射IL－17單克隆抗體阻斷IL－17的作用，可以明顯改善VMC小鼠心肌病變程度，并下調心肌組織中IL－6、TNF－α的表達水平。為了進一步探討黃芪甲甙治療VMC的機制，作者通過ELISA檢測了心肌組織IL－6、TNF－α水平，發現模型組心肌組織中IL－6、TNF－α水平顯著高于對照組，經高劑量黃芪甲甙處理后，IL－6、TNF－α水平較模型組明顯降低，提示黃芪甲甙對VMC的治療作用可能與其抑制IL－17介導的炎癥反應有關。

綜上所述，本研究結果表明IL－17在VMC小鼠心肌組織中表達升高，提示IL－17可能參與了VMC的發病過程，黃芪甲甙對VMC治療作用較好，這種作用可能與其抑制IL－17介導的炎癥反應有關，可為黃芪甲甙的進一步開發應用打下基礎。

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