1，25－二羥維生素D3對哮喘豚鼠肥大細(xì)胞類胰蛋白酶釋放的影響

夏 維，石敦義，張桂蓉

（1.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 401220；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院保健科 400010）

1，25－二羥維生素D3是維生素D的活性形式，除了調(diào)節(jié)鈣和骨代謝外，還發(fā)揮其他生物活性，如通過多種途徑參與免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)。近期大量研究表明，1，25－二羥維生素D3與哮喘慢性氣道炎癥呈明顯的負(fù)相關(guān)［1－4］，可通過多種途徑影響哮喘免疫機(jī)制［5－6］。哮喘的發(fā)病機(jī)制與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)密切相關(guān)，而類胰蛋白酶是肥大細(xì)胞最多的炎癥介質(zhì)，具有多種生物活性，是肥大細(xì)胞激活和介導(dǎo)疾病的標(biāo)志［7－8］。本研究擬通過1，25－二羥維生素D3對哮喘豚鼠干預(yù)治療后，觀察哮喘豚鼠氣道反應(yīng)性及肺組織病理、類胰蛋白酶分布的變化，探討1，25－二羥維生素D3對哮喘變態(tài)反應(yīng)方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康豚鼠30只，雌雄不限，體質(zhì)量264～362g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將30只豚鼠分為對照組（A組）、哮喘組（B組）、1，25－二羥維生素D3組（C組），每組10只。（2）主要試劑：卵清蛋白（OVA）、1，25－二羥維生素D3、氯化乙酰膽堿（Ach）均購自美國sigma公司；速眠新由第三軍醫(yī)大學(xué)提供；402型超聲霧化器購自上海四菱醫(yī)療器械廠；自制密閉有機(jī)玻璃箱6L（20cm×20cm×20 cm）；抗Tryptase單克隆抗體AA1（一抗）與SP工作試劑盒均由福建邁新公司提供。

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥方法 哮喘模型的建立：B、C組每只豚鼠腹腔內(nèi)注射10%OVA溶液1mL致敏，2周后將豚鼠置于密閉有機(jī)玻璃箱內(nèi)，用超聲霧化器噴入1%OVA溶液15～30 min。觀察豚鼠反應(yīng)，以出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快等典型的哮喘發(fā)作癥狀為成功動(dòng)物模型。A組以等量生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和霧化，方法同前，上午花生油1mL灌胃，連續(xù)15d。B組上午花生油1mL灌胃；C組1，25－二羥維生素D3以2.5μg·kg－1·d－1融入1mL花生油后進(jìn)行灌胃，均持續(xù)15d。第30天按計(jì)劃取材。

1.2.2 氣道反應(yīng)性測定 豚鼠速眠新麻醉后將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，分離暴露出頸內(nèi)靜脈和氣管，分別行頸內(nèi)靜脈及氣管插管，置于動(dòng)物肺功能檢測分析系統(tǒng)的密閉體積描記箱內(nèi)，通過動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，設(shè)置呼吸機(jī)潮氣量6mL／kg，呼吸頻率為每分鐘70次。先給予生理鹽水靜脈注射，記錄呼氣相氣道阻力（Re）并作為基礎(chǔ)值。而后分次按濃度倍增法依次靜脈注射Ach，連續(xù)記錄Ach注射前、后Re，每次待Re降至正常后再開始下一個(gè)劑量，所有動(dòng)物均給予以下4個(gè)劑量：40、80、160、320μg／kg。結(jié)果以 Re增高率（Re的實(shí)測值／基礎(chǔ)值×100%）表示。

1.2.3 肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù) 結(jié)扎豚鼠右主支氣管，插入連接有注射器的硅膠管，行肺泡灌洗2次，每次4～6 mL，回收率大于80%為成功。回收的BALF予離心機(jī)離心（1 500r／min）10min，細(xì)胞殘?jiān)?jīng)稀釋滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，40倍光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，HE染色，行細(xì)胞分類。

1.2.4 肺組織HE染色及類胰蛋白酶免疫組化染色 取右側(cè)上葉肺組織標(biāo)本，制成4μm厚的切片，作HE及類胰蛋白酶免疫組化染色，觀察氣道肺組織的病理改變及肥大細(xì)胞類胰蛋白酶顆粒分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組豚鼠一般情況比較 A組豚鼠霧化吸入生理鹽水后呼吸無任何變化，豚鼠行動(dòng)敏捷，實(shí)驗(yàn)過程中無死亡。B組豚鼠霧化吸入OVA后出現(xiàn)呼吸急促，腹式呼吸明顯，部分豚鼠可聽到哮鳴音，重者出現(xiàn)跌倒，抽搐，實(shí)驗(yàn)第1天超敏死亡1只。C組灌胃時(shí)誤入氣管死亡豚鼠1只，豚鼠初期霧化吸入OVA出現(xiàn)哮喘樣反應(yīng)，后期經(jīng)1，25－二羥維生素D3灌胃后精神飲食逐漸好轉(zhuǎn)，但較A組差。

2.2 氣道反應(yīng)性測定 3組豚鼠氣道內(nèi)阻力基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著Ach濃度的增加，B組Re較A組明顯增高（P＜0.05），尤其在160～320mg／mL時(shí)；C組與A組比較有類似變化。C組Re較B組明顯降低（P＜0.05），見表1。

2.3 支氣管BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 B組BALF細(xì)胞總數(shù)高于A組，其中以嗜酸性粒細(xì)胞增高最為明顯（P＜0.05）。C組BALF細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比例較B組明顯下降（P＜0.05），見表2。

2.4 肺組織HE染色 B組氣管黏膜組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞為主，其次為中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等；支氣管管腔縮窄，內(nèi)有大量黏液栓形成，部分氣道上皮脫落。氣道平滑肌細(xì)胞明顯增生、肥大，導(dǎo)致平滑肌層增厚。C組氣道黏膜非特異性炎癥明顯減輕，A組則無此病理改變。

表1 3組豚鼠Re比較（x±s，cm H2O／mL·s）

表2 3組豚鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類（x±s）

圖1 A組Tryptase陽性細(xì)胞表達(dá)（×400）

2.5 肺組織類胰蛋白酶免疫組化染色 A組Tryptase陽性細(xì)胞表達(dá)很少，主要散布在黏膜下、肺泡間隔，見圖1。B、C組Tryptase陽性細(xì)胞表達(dá)則明顯增多，主要聚集在氣管黏膜下、肺泡間隔、血管周圍，一些Tryptase陽性顆粒散布在細(xì)胞外，見圖2、3。B組Tryptase陽性細(xì)胞為（17.3±1.19）與 A組（3.2±0.98）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組Tryptase陽性細(xì)胞（13.9±1.87）較B組（17.3±1.19）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 B組Tryptase陽性細(xì)胞表達(dá)（×400）

圖3 C組Tryptase陽性細(xì)胞表達(dá)（×400）

3 討 論

哮喘的本質(zhì)是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥，這種慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)，常表現(xiàn)為Re增高。本實(shí)驗(yàn)采用OVA注射致敏、霧化吸入方式誘導(dǎo)復(fù)制哮喘動(dòng)物模型。B組豚鼠在霧化吸入OVA后出現(xiàn)典型的哮喘樣反應(yīng)，Re增高，BALF細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比例增高，肺組織氣管上皮細(xì)胞腫脹、脫落，管腔變窄，管壁及管腔內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，而A組則無上述改變，說明本實(shí)驗(yàn)哮喘模型制作成功。

近年來，大量研究表明維生素D與支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)，可能通過多種途徑參與了哮喘的病因?qū)W［6］。Brehm等［9］在拉丁美洲哥斯達(dá)黎加地區(qū)進(jìn)行橫斷面調(diào)查，回歸分析顯示1，25－二羥維生素D3缺乏與哮喘發(fā)病之間存在明顯相關(guān)性，且1，25－二羥維生素D3水平越低，哮喘癥狀越嚴(yán)重。Sutherland等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者中，維生素D水平與氣道反應(yīng)性、肺功能及糖皮質(zhì)激素受體密切相關(guān)，即患者血清1，25－二羥維生素D3越低，其氣道反應(yīng)性越高（表現(xiàn)為Re增高），糖皮質(zhì)激素受體敏感越低，肺功能越差。Majak等［11］在給哮喘患者補(bǔ)充維生素D后，發(fā)現(xiàn)能明顯減低氣道炎癥反應(yīng)，從而減少哮喘的急性發(fā)作。Boonstr等［12］研究發(fā)現(xiàn)，1，25－二羥維生素D3能增加輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）向Th分化的趨勢，Th1下調(diào)，Th2上調(diào)。在本實(shí)驗(yàn)中，C組經(jīng)1，25－二羥維生素D3處理后，哮喘豚鼠BALF、氣管及肺組織中的炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減輕，Re降低，提示1，25－二羥維生素D3確能減輕哮喘豚鼠的氣道炎癥反應(yīng)，降低Re。

在哮喘的變態(tài)反應(yīng)中，肥大細(xì)胞的激活至關(guān)重要，那么1，25－二羥維生素D3能否對肥大細(xì)胞的激活產(chǎn)生影響呢？類胰蛋白酶是一種相對分子質(zhì)量為134×103的中性絲氨酸蛋白酶四聚體，它高度選擇表達(dá)于肥大細(xì)胞，是肥大細(xì)胞激活的產(chǎn)物。在本實(shí)驗(yàn)中，B組豚鼠肥大細(xì)胞數(shù)量及類胰蛋白酶顆粒明顯較A組增多，證實(shí)類胰蛋白酶參與了哮喘發(fā)病過程［13－15］。經(jīng)1，25－二羥維生素D3處理后，哮喘豚鼠肥大細(xì)胞數(shù)量及釋放的類胰蛋白酶顆粒均明顯減少，說明維生素D可能有抑制肥大細(xì)胞激活及釋放類胰蛋白酶顆粒的作用。

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