氨基胍高選擇性抑制iNOS在糖尿病大鼠視網膜中的研究＊

羅大衛，鄒海東，劉 堃，鄭 志，孫曉東，許 迅，朱弼珺

（上海交通大學附屬第一人民醫院眼科 200080）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見、最嚴重的并發癥之一，也是成年人低視力和盲的主要原因［1］。DR發病機制迄今尚未完全闡明，且無有效的治愈方法，早期發現、早期治療對延緩其進展至關重要［2］。一氧化氮（NO）作為一種重要的血管活性物質，與DR中毛細血管閉塞、微循環障礙、內皮細胞增殖相關［3］。一氧化氮合成酶（NOS）是NO合成過程中的關鍵酶，可直觀反映NO在DR中的作用機制［4］。氨基胍是一類NOS抑制劑，可以抑制NOS的活性，對DR等具有一定的治療效果［5］，但是其作用途徑及機制尚不明確，因此，研究氨基胍治療DR的機制可以指導臨床用藥，對開發新的治療藥物具有一定的指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：健康雄性 Wistar大鼠共60只，體質量180～200g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（皖）2012004。在普通環境下（通風，溫度18～23℃，濕度50%～60%）飼養，自由飲水。（2）實驗試劑與儀器：氨基胍（AG，Sigma）；胰激肽原酶（常州千紅生化制藥）；鏈脲佐菌素（STZ，Alexi）；DMEM，誘導型 NOS（iNOS）、內皮細胞型NOS（eNOS）、神經型 NOS（nNOS）ELISA試劑盒購自碧云天；蛋白質提取試劑盒（碧云天），iNOS、eNOS、nNOS抗體，羊抗鼠二抗，鼠β－actin抗體購自北京中杉金橋，手術器材，CO2培養箱，光學顯微鏡，酶標儀，紫外分光光度計，離心機。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將60只大鼠分為糖尿病組、氨基胍治療組和對照組，每組20只。氨基胍治療組和糖尿病組大鼠使用STZ制造糖尿病模型。按50mg／kg稱取STZ溶于pH為4.4的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液，對禁食12h的大鼠進行腹腔注射STZ造模，注射后24～48h取尾血測血糖。造模成功標準：血糖大于16.65mmol／L，對照組20只僅腹腔注射等體積的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.2 給藥方法 氨基胍治療組大鼠每天灌胃給藥氨基胍100mg／kg，糖尿病組和對照組大鼠予等量的生理鹽水灌胃。連續灌胃給藥14d后，處死大鼠取出雙眼眼球，用生理鹽水清洗，一只放于4%多聚甲醛中固定過夜后存放于70%乙醇中，用于HE染色；另一只存放于－80℃冰箱中，用于 Western blot和PT－PCR檢測。血液在室溫下靜置0.5h后放于4℃冰箱中過夜，第2天離心后取出上清液存放于4℃冰箱中，用ELISA檢測。

1.2.3 HE染色 多聚甲醛固定過的眼球標本用石蠟包埋，連續切片，厚度5μm，常規HE法染色。

1.2.4 ELISA檢測大鼠血清iNOS、eNOS、nNOS水平 大鼠血液靜置過夜后離心，取上清液，使用iNOS、eNOS、nNOS酶聯免疫試劑盒檢測血清中iNOS、eNOS、nNOS水平。

1.2.5 Western blot檢測大鼠視網膜中iNOS、eNOS、nNOS表達水平 將大鼠眼球組織塊取出，剪碎后用蛋白質提取試劑盒提取蛋白，18 000r／min離心1h，去上清液，固定后進行蛋白質定量，然后使用SDS－PAGE電泳分離，轉移到纖維膜，封閉。在漂洗后敷iNOS、eNOS、nNOS抗體（1∶500）和β－actin抗體（1∶300），TPBS漂洗后敷二抗（1∶5 000），ECL顯色，曝光。

1.2.6 PT－PCR測定iNOS、eNOS、nNOS mRNA表達 將眼球勻漿后，用Trizol法提取總RNA，然后取2μg RNA用逆轉錄試劑盒合成cDNA，PCR擴增，擴增條件為50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，40個循環。95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。結果采用SDS軟件進行2－ΔΔCT法相對定量分析。引物序列：eNOS上游引物5′－GGA GAG ATC CAC CTC ACT GTA GC－3′，下 游 引 物 5′－CAC ATA GGT CTT AGG G－3′，擴增產物長度421bp；nNOS上游引物5′－GTG GAG GTG CTG GAG GAG TTC－3′，下游引物5′－CGG ATT CAT TCC TTT GTG TTG－3′，擴增產物長度374bp；iNOS上游引物 5′－CAA TAA CCT GAA GCC CGA AGA C－3′，下游引物5′－GTA ATC CTC AAC CTG CTC CTC AC－3′，擴增產物長度 496bp；β－actin上游引物5′－CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C－3′，下游引物5′－ACT CAT CGT ACT CCT GCT TGC T－3′，擴增產物長度227bp。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用x±s表示，多樣本均數比較采用 One－way ANOVA分析，檢驗水準α＝0.05，多樣本組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠視網膜病理組織學HE染色比較 通過光學顯微鏡觀察HE染色的大鼠視網膜切片，結果發現，對照組大鼠組織結構清晰，完成，染色較為均勻，神經節細胞排列均勻。糖尿病組大鼠缺損最為明顯，神經節細胞減少。氨基胍治療組大鼠缺損不明顯，神經節細胞略少于正常大鼠。見圖1。

圖1 各組視網膜切片HE染色（×100）

2.2 3組大鼠血清中NOS水平比較 檢測結果發現，氨基胍治療組、對照組iNOS水平顯著低于糖尿病組，對照組nNOS水平明顯低于其他兩組，3組eNOS水平差異無統計學意義（P＞0.05）。氨基胍治療組與糖尿病組比較，iNOS蛋白表達降低（P＜0.05），與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組大鼠血清中NOS水平比較s，n＝20，U／mgprot）

表1 3組大鼠血清中NOS水平比較s，n＝20，U／mgprot）

a：P＜0.05，與糖尿病組比較；b：P＜0.05，與對照組比較。

組別iNOS eNOS nNOS糖尿病組 0.393±0.092 0.263±0.051 0.313±0.031b氨基胍治療組 0.285±0.063a0.257±0.066 0.286±0.043b對照組0.276±0.076 0.249±0.058 0.216±0.074

2.3 3組大鼠NOS蛋白表達比較 Western blot結果顯示，對照組大鼠視網膜中iNOS、eNOS、nNOS蛋白表達較低，糖尿病組較高。氨基胍治療組中iNOS的蛋白表達明顯弱于糖尿病組（P＝0.039），與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、3。

圖2 3組大鼠視網膜中NOS蛋白表達比較

圖3 3組大鼠血清中NOS蛋白表達比較

2.4 3組大鼠NOS mRNA表達比較 PT－PCR檢測顯示，氨基胍可以抑制iNOS mRNA的高表達，對eNOS mRNA和nNOS mRNA的高表達影響不明顯，見表2。

表2 各組大鼠NOS mRNA表達比較s，n＝20）

表2 各組大鼠NOS mRNA表達比較s，n＝20）

a：P＜0.05，與糖尿病組比較。

組別iNOS mRNA eNOS mRNA nNOS mRNA糖尿病組1.684±0.280 1.413±0.250 1.553±0.130氨基胍治療組 1.166±0.130a1.378±0.230 1.399±0.180對照組1.209±0.210 1.105±0.190 1.018±0.210

3 討 論

DR是一種多因素、多作用途徑的糖尿病并發癥，嚴重危害人類生命健康。DR的發生受到多種條件控制，例如視網膜新生血管，細胞凋亡等等［6］，早期糖尿病的研究主要集中在細胞凋亡，細胞凋亡與DR的發病有著密切的聯系［7］。研究發現，氨基胍會引起蛋白非酶糖基化終產物（AGEs）增加，AGEs可以通過使Bc－l2／Bax的比例降低以及caspase3的活化，從而引起毛細血管周細胞凋亡［7－8］。同時，氨基胍作為一種NOS抑制劑，對NOS具有顯著的抑制作用［8－9］，并有文獻報道，氨基胍對DR的治療作用與抑制NOS有關，但是其抑制作用是否具有NOS亞型選擇作用目前并不清楚，需要進一步的研究證實［9－10］。

DR都會引起視網膜細胞的缺損，神經節細胞減少［10－11］，降低視網膜細胞的缺損，增加神經節細胞數量是治療視網膜病變的主要目的。本研究發現，使用氨基胍的大鼠視網膜細胞缺損情況減輕，神經節細胞明顯增多。說明氨基胍可以抑制糖尿病大鼠的視網膜病理性病變。

NOS分為iNOS、nNOS、eNOS 3個亞型［11－12］，它們在體內起到不同的作用。研究發現，糖尿病大鼠視網膜中iNOS mRNA水平明顯提高，iNOS陽性細胞數也顯著增多，且陽性細胞主要分布在INL［13］。有研究表明，在正常大鼠視網膜中，iNOS免疫反應沉淀物主要出現在INL的 Müller細胞中［12－15］，而此細胞是維系視網膜血管結構的重要的神經膠質細胞［16］。由此可推測iNOS產生的過多的NO有可能對血管造成損傷。因此，抑制iNOS的表達可能對治療DR具有一定的效果。本研究發現，氨基胍對iNOS的水平及表達具有顯著的抑制作用，且具有選擇性。

本研究證實了氨基胍可以改善DR，且作用途徑與選擇性地抑制iNOS有關。對于氨基胍參與多作用途徑治療糖尿病微血管病變提供了試驗依據，同時，為研究和開發新型的治療DR藥物起到一定的指導作用。

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