B7同源體3上調肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠NSE和S100bmRNA的表達＊

王延平，陳旭勤△，王浙東，張兵兵，傅豐慶，李 巖▲

（1.蘇州大學附屬兒童醫院神經內科，江蘇蘇州 215003；2.蘇州大學醫學生物技術研究所，江蘇蘇州 215004）

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumococcal，SP）是引起化膿性腦膜炎最常見的革蘭陽性細菌之一［1］。在能引起神經系統后遺癥的中樞神經系統疾病中，SP腦膜炎是最復雜，最嚴重的［2］。通過正規的抗菌藥物、激素及支持治療后，SP腦膜炎仍有高達25%的致死率，約50%的存活者遺留神經系統后遺癥［2］，多表現為智力低下、驚厥發作、聽力損害、感覺障礙和運動發育落后等［3］。因此，進一步研究細菌性腦膜炎的免疫病理機制，對治療和改善細菌性腦膜炎預后意義重大。B7同源體3（B7H3）是B7協同刺激分子家族的新成員，它不僅在T細胞介導的免疫調控中扮演者多種角色而且與SP腦膜炎的固有免疫應答有關［4］。神經元特異性烯醇化酶（NSE）是反映腦損傷的標志物［5］，S100b蛋白約96%存在于腦內，絕大部分分布于神經膠質細胞中，是反映腦組織損傷的標志蛋白［6］。作者的前期研究發現，在確診細菌性腦膜炎患者的腦脊液中，B7H3的表達顯著升高［7］，并且在小鼠SP腦膜炎中，證實了B7H3是通過TLR－2機制增強了腦內炎癥反應，并且加劇了血腦屏障的破壞［4］。本研究是在既往實驗的基礎上，通過觀察B7H3對SP腦膜炎小鼠的臨床癥狀以及檢測腦損傷標志物NSE和S100b的基因表達的作用，進一步分析B7H3對SP腦膜炎中腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：BALB／C小鼠共48只，由上海實驗動物中心（斯克萊公司）提供。試劑：SP3型購自American Tissue Cell Culture Collection（ATCC，Manassas，VA），菌號：ATCC 6303；mB7H3蛋白購自美國R＆D公司；NSE、S100b和β－action三對引物均由上海博亞（英駿）有限公司設計；Trizol試劑購自上海博亞（英駿）有限公司；Prime Script RT reagent kit Perfect Real Time試劑盒、SYBR Premix Ex TaqII（Perfect Real Time）試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNeasy?Mini Kit購自凱杰生物技術（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將48只BALB／C小鼠分為4組，每組12只。生理鹽水組（CON組）定位后向側腦室注入15μL 0.9%氯化鈉，B7H3蛋白組（B7H3組）定位后向側腦室注入10μL濃度為0.33μg／μL的B7H3蛋白＋5μL 0.9%氯化鈉，SP組定位后向側腦室注入10μL 0.9%氯化鈉＋5μL濃度為1.5×104cfu／mL），SP＋B7H3組。以上各實驗組小鼠按處死時間分為18h組、48h組、72h組，術后置于室溫20～25℃，光線明、暗各12h，自由飲食飼養。

1.2.2 細菌與化膿性腦膜炎的制備 將菌種ATCC 6303接種于血瓊脂糖固體培養基上，置于37℃、5%的CO2培養箱中過夜。挑取單個菌落，接種于含有15mL腦心浸液的50mL的離心管中，傾斜插入37℃恒溫搖床中，以240r／min振速搖過夜；取350μL細菌懸液接種于腦心浸液中，240r／min 37℃恒溫搖床培養6～8h，此時細菌生長至對數生長期，收菌，3 000r／min離心20min，離心后在管底可見乳白色沉淀，棄上清液，取10mL無菌的PBS沖洗細菌沉淀；再同前離心1次，棄上清液后用無菌PBS 10mL重懸沉淀，充分吹打混勻后，取100μL，仍用無菌PBS進行倍比稀釋余下細菌離心，將只含有細菌沉淀的離心管用封口膜封住放入－20℃冰箱中備用；倍比稀釋后的細菌各取100μL進行涂板，置于37℃、5%的CO2培養箱中培養；24h后計數血平板上的菌落，計算保存備用的細菌總數。在制作化膿性腦膜炎時，用0.9%氯化鈉稀釋備用細菌沉淀，制成濃度為1.5×104cfu／mL的SP懸液。

小鼠腦膜炎模型采用改進的Diab的側腦室注射法［8］，首先用麻醉劑戊巴比妥鈉（濃度1.0%）60mg／kg，腹腔注射誘導深度麻醉，然后俯臥位固定小鼠，在小鼠頭正中沿矢狀位做一個長1.5cm左右的切口，暴露顱骨結構，可見各額、頂骨結構界限，準確定位：前囟后約0.5mm，中線右旁開1.0mm為進針處，垂直深度為2.5～3.0mm，然后將15μL的細菌懸液（1.5×104cfu／mL）在約2min內緩慢、勻速地注入側腦室，留置針頭于顱內1min后緩慢拔出（控制好注入速度和退針速度，以防由于速度過快引起的顱內壓急劇升高和退針過快注入的液體外溢而影響注入側腦室的液體量）。為證實定位準確，按以上定位方法向側腦室內注射藍黑墨水，3～5min后頸椎脫臼處死，解剖腦部結構，可見藍黑色墨水已通過腦脊液迅速擴散至脊髓腔顱底窩小腦延髓池雙側側腦室。

1.2.3 神經行為學評分 在18、48、72h時分別對各組小鼠（n＝4）進行神經行為學評分，評分標準采用Loeffler的神經行為學5分制評分方法［9］。5分：抓住背部時能正常活動，在5s內翻身成功；4分：自主運動減少，5s內能翻身；3分：翻身可以成功，但時間超過5s；2分：不能翻身；1分：不能運動；0分：死亡。

1.2.4 實時－PCR 側腦室注射后18、48、72h，將各組小鼠（n＝4）用1%戊巴比妥鈉（60mg／kg）腹腔注射麻醉，快速頸椎脫臼處死，在冰塊上斷頭，將腦組織迅速放入液氮中快速凍。待行實時－PCR檢測。采用TRIZOL抽提法提取小鼠腦組織勻漿中的總RNA，抽提的總RNA，使用RNeasy?Mini Kit進行純化，操作步驟嚴格按照說明書進行，取純化后的RNA 500ng進行逆轉錄，逆轉錄操作步驟按照Prime Script RT reagent kit Perfect Real Time執行，逆轉錄條件如下：37℃15min，85℃5s。特異性引物如下：NSE上游引物5′－TCA TTC TCC TGG AGC CTC TT－3′，下 游 引 物 5′－AAG AGC AGA GAG AGC AAG G－G－3′；S100b上游引物5′－TGC CCT CAT TGA TGT CTT CCA－3′，下游引物5′－GAG AGA GCT CGT TGT TGA TAA GCT－3′；β－actin上游引物，5′－GGT CAT CAC TAT TGG CAA CG－3′，下 游 引 物 5′－ACG GAT GTC AAC GTC ACA CT－3′。實時－PCR的操作按照SYBR Premix Ex TaqII（Perfect Real Time）的說明書進行，反應條件如下：95℃30s1個循環，95℃5s，60℃30s，72℃30s35個循環，72℃15min 1個循環。

1.2.5 NSE、S100bmRNA的相對表達量的計算 采用2－ΔΔct方法計算mRNA的相對量，以β－actin基因為內參基因，對NSE、S100bmRNA進行均一化處理，利用熒光閾值（Ct值）計算NSE、S100bmRNA的相對表達量。

1.3 統計學處理 所有數據采用SPSS18.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以s表示，數據作正態性W 檢驗和方差齊性Levene檢驗；滿足條件者多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗；不滿足條件者采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 B7H3對小鼠神經行為學評分的影響 各時點B7H3組神經行為學評分與CON組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同時間點SP組較 CON組降低（P＜0.05）；SP＋B7H3組與SP組比較，評分進一步降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠不同時間點神經行為評分比較（s）

表1 各組小鼠不同時間點神經行為評分比較（s）

a：P＜0.05，與SP組比較；b：P＜0.05，與SP＋B7H3組比較。

18h 48h 72h CON組 4 5.000±0.000a5.000±0.000a5.000±0.000組別 n a B7H3組 4 5.000±0.000a5.000±0.000a5.000±0.000a SP組 4 4.500±0.577b 3.500±0.577b 2.750±0.500b SP＋B7H3組4 4.000±0.000 3.000±0.000 1.750±0.500

2.2 實時－PCR特異性產物 實時－PCR產物具有高度特異性，電泳條帶如圖2。

圖2 實時－PCR特異性產物

2.3 B7H3對腦膜炎時腦損傷標志物NSE、S100bmRNA相對表達量的影響 在細菌注射后18、48、72h，B7H3組與CON組比較，NSE、S100bmRNA相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；不同時間點SP組NSE、S100bmRNA相對表達量較CON組明顯升高（P＜0.05）；各時間點SP＋B7H3組NSE、S100bmRNA相對表達量較SP組進一步升高（P＜0.05）。見表2、3。

表2 4組小鼠各時間點腦組織NSE mRNA水平比較（）

表2 4組小鼠各時間點腦組織NSE mRNA水平比較（）

a：P＜0.05，與SP組比較；b：P＜0.05，與SP＋B7H3組比較。

18h 48h 72h CON組 4 0.028±0.006a0.028±0.003a0.028±0.001組別 n a B7H3組 4 0.052±0.034 0.020±0.001 0.036±0.002 SP組 4 0.095±0.030b 0.177±0.021b 0.369±0.035b SP＋B7H3組4 0.124±0.049 0.330±0.088 0.529±0.020

表3 4組小鼠各時間點腦組織S100bmRNA水平比較s）

表3 4組小鼠各時間點腦組織S100bmRNA水平比較s）

a：P＜0.05，與SP組比較；b：P＜0.05，與SP＋B7H3組比較。

18h 48h 72h CON組 4 0.032±0.006a0.029±0.002a0.046±0.002組別 n a B7H3組 4 0.040±0.018 0.029±0.003 0.048±0.001 SP組 4 0.061±0.057b 0.185±0.012b 0.284±0.008b SP＋B7H3組4 0.148±0.052 0.194±0.018 1.620±0.118

3 討 論

B7H3是B7協同刺激分子家族的新成員，作者的臨床資料表明，在確診細菌性腦膜炎患者的腦脊液中，相對于病毒性腦炎患兒可溶性B7H3的表達顯著升高［7］，推測B7H3蛋白在細菌性腦膜炎的病理、生理過程中發揮著重要作用。在本研究中，通過側腦室注射SP懸液建立SP腦膜炎小鼠模型，并且選取術后18、48、72h時間點動態觀察腦膜炎的癥狀。本研究發現在側腦室注射后18h，SP組神經行為學評分較CON組降低，說明實驗組小鼠在細菌感染后18h就已經出現了腦膜炎臨床癥狀；在細菌注射后48、72h時，SP組與CON組比較評分呈下降趨勢，表明隨著時間的推移腦膜炎小鼠的病情逐步加重。SP和B7H3蛋白的聯合注射與SP單獨注射相比，神經行為學評分進一步下降，表明在SP感染的前提下B7H3加劇了SP腦膜炎的病情進展。同時還發現B7H3蛋白單獨注射小鼠的神經行為評分在各時間點均較CON組無變化，表明B7H3蛋白本身對正常小鼠無影響，這與作者最近的研究結果相符［4］。

除臨床癥狀外，本研究中還運用了實時－PCR技術檢測腦組織勻漿中腦損傷標志物NSE、S100bmRNA的表達。NSE是一種細胞質中的糖酵解酶，是存在于神經元內的形式，它是由γγ二聚體組成的，相對分子質量為78×103，半衰期為24 h［10］，它特異性存在于神經元尤其是中樞神經系統成熟的神經元內，當神經元遭受各種應激狀態時會將其釋放［11］。有研究表明，NSE血清水平亦越高，腦損傷的程度越重［12］。S100b蛋白是一種相對分子質量只有21×103的鈣結合蛋白，生物半衰期為2h，它是由ββ組成的同源二聚體，在中樞神經系統的星形膠質細胞中高表達并由它分泌［13］。當S100b水平異常升高時，它可以通過促炎癥細胞因子的表達增加而產生有害影響促進細胞凋亡［14］。亦有研究表明，S100bmRNA在成年和老年小鼠的創傷性腦損傷中的表達是上調的［15］。在本研究中，實時－PCR結果顯示，細菌接種后18、48、72h，SP組小鼠 NSE、S100bmRNA相對表達量較CON組明顯升高，表明在基因水平，SP感染誘導了小鼠腦組織中NSE、S100b的表達，SP＋B7H3組小鼠的S100bmRNA相對表達量較SP組更進一步升高，而在S100b、NSE mRNA結果中均發現B7H3組和CON組差異無統計學意義（P＞0.05）。結合SP腦膜炎小鼠的同步的神經行為學評分的動態觀察，本結果顯示，在腦膜炎的病情進展中，B7H3在SP感染的基礎上上調了SP腦膜炎小鼠腦損傷標志物NSE、S100b基因的表達。

綜上所述，本研究發現在SP腦膜炎小鼠中，B7H3蛋白干預加劇了SP腦膜炎的臨床癥狀，并且對腦損傷標志物NSE、S100b的基因表達發揮了上調作用。因此，可以認為協同刺激分子B7H3在細菌性腦膜炎引起的腦損傷可能發揮著積極作用。這一研究結論為B7H3作為細菌性腦膜炎干預治療的潛在靶點提供了實驗依據。深入探討B7H3加劇SP腦膜炎腦損傷的信號機制，正是作者后續研究中的主要內容。

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