耐熱真菌產木聚糖酶的固體發酵條件

陳功+張巍+李思佳+熊海容

摘要：對嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）DSM 10635的固體培養基進行改良。設計的間歇通氣的培養裝置，簡化掉補水操作后，簡化了操作并降低了培養基成本，單瓶玉米芯干粉量為120 g/L，增大了培養瓶的利用率，第5天菌絲已基本充滿整個培養體系，同時單批木聚糖酶活力最高為53 710 IU/g。

關鍵詞：木聚糖酶；固體發酵；間歇通氣；酶活力

中圖分類號：TS201.3；TQ929文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2395-03

Thermostable Xylanase Production with the Solid-state Fementation

CHEN Gong，ZHANG Wei，LI Si-jia，XIONG Hai-rong

（Engineering Research Centre of Bioresource in Southern China，College of Life Science，South-central University for Nationalities，

Wuhan 430074，China）

Abstract：Xylanase production with solid-state fementation of Thermomyces lanuginosus DSM 10635 was optimized. Under the water-saturated aeration device and the optimal culture media， the amount of corncob powder per bottle was 120 g/L. The utilization rate of culture bottle was increased. The mycelium filled up the whole culture system after 5 d and the xylanase productivity was up to 53 710 IU/g.

Key words： ylanases；solid state fermentation； intermittent ventilation； enzyme activity

基金項目：武漢市科技攻關項目（2013020501010180）

木聚糖酶（Xylanase，EC 3.2.1.8）是一種內切β-1，4-木聚糖苷酶。這種酶水解半纖維素中的木聚糖（Xylan）為可代謝的低分子寡聚木糖，對疏松原材料組織結構有重要意義[1-3]。嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）DSM 10635是一種耐熱型菌株，所產的木聚糖酶1YNA具有良好的耐熱性和熱穩定性，能較好地應用于酶法水解木聚糖的高溫處理過程[4，5]，能廣泛應用于半纖維相關的燃料酒精工業、制漿造紙工業、飼料和食品工業。

目前，已有用基因工程的方法從Thermomyces lanuginosus DSM 10635中提取木聚糖酶基因片段導入畢赤酵母中高效表達和工業化生產的研究[6，7]。但未見有該菌株固體發酵工業化生產的報道。固體發酵有獨特的優點，所使用的培養基簡單便宜；原料不需糖化液化，處理簡單；產物提取容易；固體發酵后的物料可直接作為產物；廢水排放量大大減少；單位體積的培養基生產能力高于液體培養基；不易污染雜菌；設備簡單等。試驗借鑒已報道的最適pH，最適培養溫度等條件[8，9]，從適應工業化生產的角度對Thermomyces lanuginosus DSM 10635的固體發酵條件進行改良。

1材料與方法

1.1材料與培養基

1.1.1原料與試劑 玉米芯，菌種為Thermomyces lanuginosus DSM 10635；3，5-二硝基水楊酸（DNS），標準木糖溶液，0.5%木聚糖-磷酸緩沖液（pH 6.5），檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 6.5）。其他所用藥品均為分析純。

1.1.2培養基液體種子培養基：馬鈴薯液體培養基（PDA）；玉米芯固體培養基：將玉米芯粉碎成粉末，稱120 g玉米芯干粉于1 L錐形瓶中，按料液比1∶3（g∶mL）添加培養液，在121 ℃下滅菌20 min，靜置冷卻。

1.2試驗方法

1.2.1試驗裝置試驗裝置示意圖如圖1所示。

1.2.2培養基廉價化修改修改后的培養基各成分見表1。

1.2.3培養方法

1）菌種活化。挑取實驗室保存的Thermomyces lanuginosus DSM 10635菌種于去離子水中制成懸浮液，并對懸浮液稀釋后進行平板涂布，在50 ℃下培養3 d后，置于4 ℃下保藏。

2）種子液的制備。挑取上述平板的單菌落接種于PDA培養基中，于50 ℃ 200 r/min條件下培養3 d，接種于玉米芯固體培養基。

3）固體發酵。每份固體培養基按約10%（V/W）的接種量匯總，放入電控恒溫培養箱中50 ℃培養，每隔12 h通氣15 min，每隔24 h搖晃錐形瓶一次。

4）培養基含水率的計算。培養7 d后，于超凈工作臺上從錐形瓶中取出少量培養基，置于相應的干凈培養皿中。取樣后將錐形瓶放入電控恒溫培養箱中繼續培養。將盛有樣品的培養皿放入電熱恒溫干燥箱中于60 ℃下烘干約24 h，直至質量不再發生變化，即得到培養皿中培養基的絕干重，并記錄其重量以計算含水率。培養第9天重復上述操作。

5）粗酶液的提取。稱取烘干后的培養基放入250 mL的錐形瓶，加入100 mL檸檬酸磷酸緩沖液（pH 6.5），放入搖床在160 r/min，50 ℃條件搖瓶10 h，得上清液即為粗酶液。

1.2.4酶活力測定1個國際酶活力單位：在60 ℃和pH 6.5條件下，每分鐘水解產生1 μmol還原糖所需酶量，還原糖以木糖為標準，測定酶活力[6]。

2結果與分析

2.1培養基改良后生長狀況

圖2為培養基改良前后培養5 d后的生長情況，結果表明嗜熱真菌DSM 10635在改良后的培養基上生長良好，第5天菌絲已基本充滿整個培養體系。

2.2固體發酵失水量記錄

在改良后的固體培養體系下，三角瓶內含水率隨著培養時間的增加不斷降低，發酵7 d后含水率為58%，9 d后含水率為52%（圖3），表明培養基瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤空氣的方法，很大程度上保持了培養基含水率，使發酵條件始終處在相對平穩的狀態。

2.3酶活力測定結果

由于固體發酵營養成分分布不均一，菌種生長代謝不均一，同等條件下做了3批試驗。培養到第7天和第9天時檢測酶活力（圖4）。由圖4可知，3批發酵試驗平均酶活力為34 831 IU/g，單批試驗最高酶活力達到53 710 IU/g。

3小結與討論

利用DSM 10635在改良后的培養基上生產木聚糖酶，其酶活力單批最高可提高到53 710 IU/g，這一酶活力也是目前國內較高水平，同時由于同體積的三角瓶中培養基增加了1倍，單瓶產酶能力得以提高。試驗設計的間歇通氣的固體發酵方法，簡化了發酵步驟，培養基的廉價優化降低了培養基成本，這些結果對工業化生產有積極的意義。

利用DSM 10635在改良后的培養基上生產木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培養液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生長的多種無機鹽，使菌株在固體培養基中快速生長和產物積累；間隔通氣的試驗裝置為菌株生長代謝提供了更多的氧氣，同時也提高了培養基的傳熱效率，避免了因代謝產熱而導致的局部高溫對木聚糖酶活力的影響；每天補水不但加大了試驗操作的復雜程度，帶來染菌風險，而且會使得固體培養基的營養成分分布不均衡，影響菌株生長，采用在培養瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤空氣的方法，很大程度上保持了培養基含水率，使發酵條件始終處在相對平穩的狀態。

參考文獻：

[1] XIONG H R，WEYMARN N V，TURUNEN O，et al. Xylanase production by trichoderma reesei rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：753-759.

[2] SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus： properties of strains and their hemicellulases[J].FEMS Microbiol Rev ，2003，27（1）：3-16.

[3] 張繼泰，曾小英，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶與稀酸聯合水解甜菜渣生產L-阿拉伯糖的初步研究[J].中南民族大學學報（自然科學版），2009（4）：50-53.

[4] XIONG H R，NYYSSOLA A，JANIS J，et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM 10635[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：93-99.

[5] 農旭華，張繼泰，王玉瑛，等.嗜熱真菌DSM 10635生產耐熱木聚糖酶的小試研究[J].工業微生物，2009（3）：62-66.

[6] 李思佳，王亞偉，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶 1YNA 及其雙硫鍵突變體在畢赤酵母中的表達[J].中國生物工程雜志，2013，33（3）：74-79.

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[9] 周薇薇，尹亞輝，趙長新.響應面法優化黑曲霉固態發酵產木聚糖酶工藝[J].大連工業大學學報，2013（3）：176-179.

1.2.4酶活力測定1個國際酶活力單位：在60 ℃和pH 6.5條件下，每分鐘水解產生1 μmol還原糖所需酶量，還原糖以木糖為標準，測定酶活力[6]。

2結果與分析

2.1培養基改良后生長狀況

圖2為培養基改良前后培養5 d后的生長情況，結果表明嗜熱真菌DSM 10635在改良后的培養基上生長良好，第5天菌絲已基本充滿整個培養體系。

2.2固體發酵失水量記錄

在改良后的固體培養體系下，三角瓶內含水率隨著培養時間的增加不斷降低，發酵7 d后含水率為58%，9 d后含水率為52%（圖3），表明培養基瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤空氣的方法，很大程度上保持了培養基含水率，使發酵條件始終處在相對平穩的狀態。

2.3酶活力測定結果

由于固體發酵營養成分分布不均一，菌種生長代謝不均一，同等條件下做了3批試驗。培養到第7天和第9天時檢測酶活力（圖4）。由圖4可知，3批發酵試驗平均酶活力為34 831 IU/g，單批試驗最高酶活力達到53 710 IU/g。

3小結與討論

利用DSM 10635在改良后的培養基上生產木聚糖酶，其酶活力單批最高可提高到53 710 IU/g，這一酶活力也是目前國內較高水平，同時由于同體積的三角瓶中培養基增加了1倍，單瓶產酶能力得以提高。試驗設計的間歇通氣的固體發酵方法，簡化了發酵步驟，培養基的廉價優化降低了培養基成本，這些結果對工業化生產有積極的意義。

利用DSM 10635在改良后的培養基上生產木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培養液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生長的多種無機鹽，使菌株在固體培養基中快速生長和產物積累；間隔通氣的試驗裝置為菌株生長代謝提供了更多的氧氣，同時也提高了培養基的傳熱效率，避免了因代謝產熱而導致的局部高溫對木聚糖酶活力的影響；每天補水不但加大了試驗操作的復雜程度，帶來染菌風險，而且會使得固體培養基的營養成分分布不均衡，影響菌株生長，采用在培養瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤空氣的方法，很大程度上保持了培養基含水率，使發酵條件始終處在相對平穩的狀態。

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2結果與分析

2.1培養基改良后生長狀況

圖2為培養基改良前后培養5 d后的生長情況，結果表明嗜熱真菌DSM 10635在改良后的培養基上生長良好，第5天菌絲已基本充滿整個培養體系。

2.2固體發酵失水量記錄

在改良后的固體培養體系下，三角瓶內含水率隨著培養時間的增加不斷降低，發酵7 d后含水率為58%，9 d后含水率為52%（圖3），表明培養基瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤空氣的方法，很大程度上保持了培養基含水率，使發酵條件始終處在相對平穩的狀態。

2.3酶活力測定結果

由于固體發酵營養成分分布不均一，菌種生長代謝不均一，同等條件下做了3批試驗。培養到第7天和第9天時檢測酶活力（圖4）。由圖4可知，3批發酵試驗平均酶活力為34 831 IU/g，單批試驗最高酶活力達到53 710 IU/g。

3小結與討論

利用DSM 10635在改良后的培養基上生產木聚糖酶，其酶活力單批最高可提高到53 710 IU/g，這一酶活力也是目前國內較高水平，同時由于同體積的三角瓶中培養基增加了1倍，單瓶產酶能力得以提高。試驗設計的間歇通氣的固體發酵方法，簡化了發酵步驟，培養基的廉價優化降低了培養基成本，這些結果對工業化生產有積極的意義。

利用DSM 10635在改良后的培養基上生產木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培養液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生長的多種無機鹽，使菌株在固體培養基中快速生長和產物積累；間隔通氣的試驗裝置為菌株生長代謝提供了更多的氧氣，同時也提高了培養基的傳熱效率，避免了因代謝產熱而導致的局部高溫對木聚糖酶活力的影響；每天補水不但加大了試驗操作的復雜程度，帶來染菌風險，而且會使得固體培養基的營養成分分布不均衡，影響菌株生長，采用在培養瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤空氣的方法，很大程度上保持了培養基含水率，使發酵條件始終處在相對平穩的狀態。

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