利用SPR生物傳感器檢測缺血修飾白蛋白*

李 廣， 陳龍聰， 李 賢， 楊 萌， 陳萌夢， 熊興良

(1.重慶醫科大學 生物醫學工程實驗室，重慶400016；

2.重慶大學 生物力學與組織工程教育部重點實驗室，重慶 400044)

0 引 言

由于非心臟原因胸痛的發生率很高，所以,鑒別短暫心肌缺血和心絞痛病人一直為臨床上的一個重要挑戰。利用心電圖檢測ST段抬高只能提供有限的靈敏度和特異性。在缺乏心肌缺血“金標準”檢測方法的情況下，病人需要在12～24 h內頻繁地接受一系列煩瑣的非特異性排查測試。盡管心肌壞死生化標志物如肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin,Myo)和肌鈣蛋白(cardiac troponin,cTn)對于治療是非常重要的參數，但這些物質僅在細胞出現不可逆病變6 h后才從心肌細胞中釋放出來。因此，不能用于心肌缺血的早期診斷。

無論病人是否出現心肌梗死，在病人癥狀剛發生時(cTn出現之前)，尋找一種可靠、快速、低檢測限的心肌缺血檢測方法顯得非常必要。缺血修飾白蛋白(ischemia modified albumin,IMA)是近年FDA批準的用于評估心肌缺血的唯一生化標志物，現廣泛采用的IMA檢測方法是由Bar-Or等人[1]建立的白蛋白結合鈷試驗(AC試驗)。但該方法不是直接檢測IMA，而是通過間接檢測血液中白蛋白(human serum albumin,HSA)與鈷離子結合從而間接檢測IMA，因此,ACB法的檢測結果假陽性偏多；另外，當患者血液中白蛋白濃度低于34 g/L[2]時，該方法無法用于檢測IMA。再者，ACB法需使用染色劑DTT，該物質不穩定，熔點很低，在空氣易揮發，且含有刺激性氣味，對人體健康會造成影響。近年來又有學者[3]提出了ELISA方法檢測IMA，但檢測時間較長(大于1 h)，處理過程復雜，操作過程繁瑣。

SPR生物傳感器基于入射光與金屬表面的等離子發生共振的原理，建立探測生物分子間相互作用的生化分析技術，具有實時、快速、靈敏、免標記及特異性強等優點。已在病毒、蛋白質和DNA等生化物質檢測[4]方面存在大量應用。但傳統的SPR檢測方法難以檢測超低濃度的生物分子。近年來，人們開始應用各種材料如液晶分子、生物素—親和素、納米金、磁納米微球、碳納米管進行信號增強以提高SPR生物傳感器的靈敏度[5]。其中，由于納米金具有高密度、高介電常數以及高比表面積等優點，有利于提高生物識別分子的固定量，從而極大地增強檢測信號，提高檢測靈敏度。

本文利用納米金顆粒和混合巰基自組裝于金膜表面上，研制了一種快速、低檢測限的SPR生物傳感器，并比較了直接檢測法與間接檢測法對IMA檢測下限的影響。

1 實 驗

1.1 芯片表面預處理

將50 ℃，體積分數為30 %H2O2∶98 %H2SO4=1∶3的Piranha溶液清洗傳感器金膜表面30 min，再用去離子水清洗3次后，氮氣吹干備用。

1.2 蛋白質的固定

取10 mmol/L MHA(11—巰基十一酸)與MUOH(11—巰基十一醇)混合物(MHA∶MUOH=1∶9)滴于預處理后的芯片表面，在室溫下避光反應24 h，使其表面形成一層巰基自組裝單分子層。然后用酒精沖洗芯片表面，隨后用大量去離子水沖洗，氮氣吹干。隨后，將0.1 mol/L NHS和0.4 mol/L EDC等體積混合，取20 μL滴于金膜表面反應5 h，交聯活化金膜，使羧基與氨基交聯在一起，提高結合的穩定性。取IMA(或抗IMA)20 μL滴于芯片表面反應8h后，用去離子水沖洗芯片表面5次，氮氣吹干。然后，滴加1 mol/L,pH=8.5的鹽酸乙醇胺溶液，封閉多余的羧基，以減少結合過程中羧基對IMA(或者抗IMA)的非特異性吸附。最后將制備好的傳感器芯片放于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 IMA—納米金復合物制備

將IMA與10 nm 納米金顆粒的溶液混合于pH=9的0.1 mol/L的K2CO3溶液中，振蕩4 h，然后在4 ℃下以9 000 r/min轉速冷凍離心25 min。移去上清液，沉淀用pH=7.4的PBS稀釋。

1.4 檢測方法

直接檢測法：將固定有抗—IMA的傳感器芯片安裝好，然后以20 μL/min通入不同濃度(0～100 mg/L)的IMA溶液，使芯片上的抗IMA與IMA充分結合。每次測試完成后需通入pH=13的100 mmol/L NaOH +0.05 % SDS混合溶液進行再生，以備下次使用。

抑制檢測法：不同濃度(0～100 mg/L)的抗IMA與800 mg/L IMA混合后，以20 μL/min流速通入固定有IMA的芯片表面，反應3 min，使溶液中的IMA抑制抗體與芯片表面的IMA結合，接著通入25 mg/L的抗IMA，改變IMA濃度重復實驗。再生方法同上。

IMA—納米金復合物方法操作同上。不同濃度(0～100 mg/L)的抗IMA與納米金顆粒體積比為0.71的IMA—納米金顆粒混合以后，以20 μL/min通入芯片表面3 min；然后，再通入3 mg/L的抗IMA+不同體積比(0～1)的IMA—納米金顆粒復合物。

2 結果與討論

2.1 IMA特異性對照實驗

由于人血液中含有肝素、血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物質，因此，本實驗首先考察了該方法的特異性來驗證上述物質是否會對檢測造成影響。實驗通過配置相同濃度的IMA水溶液和血漿溶液，然后分別通入固定有抗IMA的傳感器進行檢測，SPR響應結果如圖1所示。圖中可以發現二者的響應值非常接近，含相同濃度的IMA水溶液和血漿溶液的SPR響應值分別為：1572±96RU和1625±137RU。說明血漿中的物質幾乎不對檢測結果造成干擾，即該方法具有很好的特異性。

圖1 IMA水溶液與含相同濃度IMA血漿溶液的SPR響應對比(實驗條件：IMA=100mg/L，采用納米顆粒)

2.2 單一自組裝與混合自組裝芯片比較

本實驗采用裸金芯片，與常用的CM5芯片相比，自組裝裸金芯片少了100 nm糖苷層，使得納米金顆粒與芯片表面更為接近，SPR現象更明顯。同時，這些糖苷結構會引起某種空間效應，自組裝方法能很好地解決這一問題。由于 CM5芯片表面含有羧基，要想把蛋白質牢固地連接在芯片表面，須用巰基酸。常用的巰基酸如MUA,MHA等，有文獻報道巰基醇[6]具有穩定作用，常用的巰基醇如MPOH(3—巰基丙醇)，MUOH(11—巰基十一醇),且巰基醇與巰基酸混合對于蛋白質的固定有獨特的優勢。相同碳原子數的組合占據蛋白質的固定空間，而不同碳原子數的組合就充分利用了空間高低排布，巰基醇對蛋白質固定不會造成空間影響。而碳原子數少的巰基相對于多的來說，含碳越少越不穩定，揮發性越強，含碳多的巰基在室溫下做實驗有利于保持蛋白質活性。本實驗分別測試了單獨采用MUA自組裝和MHA與MUOH混合巰基自組裝，實驗結果證實了混合巰基自組裝性能更優越(如圖2所示)。Lee E G等人[7]研究表明，這個組合比例為1∶9時，對于蛋白質的固定具有最高的SPR響應信號。本文采用的混合比也是1∶9。

圖2 混合自組裝與單一自組裝的SPR響應比較(IMA=80 g/L)

2.3 納米金粒子信號放大作用

納米金顆粒具有量子尺寸效應，可以自由給出和獲取電子，同時，由于其比表面積高，十分有利于提高生物傳感器中生物識別分子的固定量，進而降低檢測下限。納米金顆粒用于增強生物傳感器的信號已有許多報道，但是不同直徑的納米金顆粒對于信號放大效果并不完全相同。Fernández F[8]的研究表明：SPR上采用10～20 nm金納米顆粒信號的增強效果最顯著，所以,本實驗選用直徑為10 nm的納米金顆粒。

圖3為有無納米金顆粒參與反應下的SPR響應差異對比。圖中可以發現，在相同IMA濃度下，有納米金顆粒參與的反應比沒有納米金顆粒參與的反應，其SPR響應信號得到了極大地增強。前者的響應信號比后者提高將近10倍左右。因此，采用納米金顆粒可以使生化物質的檢測限得到明顯的改善。

圖3 加入納米金前后SPR響應值比較(IMA=100 mg/L)

2.4 2種檢測法比較

將IMA固定在芯片表面后，將不同濃度的抗IMA溶液通過芯片表面將產生響應信號。利用直接檢測法可以檢測到372 ng/L。對于濃度高于393.7 ng/L的IMA，可以直接通過SPR檢測，不需要納米金顆粒等的放大作用，直接進行檢測。但對于濃度低于393.7 ng/L時，特別是患者剛剛出現心肌缺血時，血液中IMA含量很低(正常人為0)，直接利用SPR檢測就很難檢測到信號變化，所以，直接法檢測IMA濃度遠遠不能達到診斷目的。而抑制法就能很好地解決這個問題。通入不同濃度的IMA或IMA—納米金顆粒復合物與抗IMA混合溶液。芯片表面固定的IMA越少，抗IMA裸露的位點越多，當注入IMA或IMA—納米金顆粒復合物后，與抗IMA特異性結合產生的SPR信號越大。顯然，加入納米金顆粒極大地增強傳感器響應信號，利用抑制法檢測限小于5.0 ng/L。實驗中分別測試了不同濃度IMA產生的響應信號。

與直接檢測法相比，抑制檢測法在低濃度檢測中具有獨特優勢。3種情況下批間的變異系數(標準差/3種物質平均值)分別為3.8 %，0.9 %，0.7 %。批內的變異系數(標準差/5個單獨檢測平均值)分別為16.4 %，10.9 %，9.6 %。在自組裝芯片表面，通過注入IMA溶液，SPR信號增強了6.1倍，然而，加入納米金以后，SPR信號增加了9.3倍，極大地改善了檢測限。直接檢測時，芯片表面只通入抗IMA，抗體最低濃度為50 mg/L可得到響應信號，而通入IMA溶液以后，抗體濃度只需25 mg/L,加入納米金顆粒以后，抗體濃度可以低到3 mg/L。3種情況下IMA檢測限分別為393.7±78，45.3±6.4，5.0±1.6 ng/L。表1給出了2種檢測的具體數據。結果表明：通過這種自組裝納米金方法，得到了更高的靈敏度，有效地增強了響應信號，同時，極大的降低了檢測限。

表1 SPR檢測IMA各項測試結果

3 結 論

SPR生物傳感器與其他方法相比，SPR預處理簡單，用時短，可以同時測定多種樣品。但由于儀器費用較高，而且IMA固定后要在一個星期內使用才能保持活性，所以,SPR還不是一種廣泛使用的方法。目前本實驗提供的方法還只能在實驗室實現，但從初步的實驗結果看，由于該方法具有特異性好、檢測下限低，以及檢測耗時短等優點，因此，對于心肌缺血的早期診斷具有較好的應用前景。

參考文獻:

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