基于Ag納米粒子的LSPR傳感器裝置設計與實現*

劉憲華， 石瀟璇， 楊嬌鳳， 米 瑪

(1．天津大學 環境科學與工程學院，天津 300072；

2．西藏自治區環境監測中心站，西藏 拉薩 850000)

0 引 言

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)傳感技術作為一種生化檢測方法，可以實時在線檢測，無需標記待測物，耗樣量少[1]，但由于SPR生物傳感器設備體積大，價格昂貴，對溫度等實驗條件要求嚴格，真正高精度自動化的商業檢測裝置難以推廣[2]。局域表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance，LSPR)技術不僅繼承了SPR技術的優點，而且克服了SPR技術的不足，裝置小型化，成本低廉，受溫度等實驗條件的影響小[3]。LSPR在生物傳感器方面的應用受到越來越多的關注，包括利用膠體聚集的生物傳感器用于蛋白識別[4]和酶活性探測[5]以及用于檢測抗原—抗體識別[6,7]，激素藥物檢測[8,9]。透射光譜檢測方法是LSPR生物傳感器常用的檢測方法之一，可以直接在比色皿中進行檢測。它的缺點是每次檢測時LSPR芯片位置會發生改變，導致檢測結果不準確。將檢測池設計成為流動池，能夠避免檢測過程中換樣時芯片移動產生的誤差。但是先制備芯片后檢測，步驟繁瑣，穩定性差的問題依然存在。

本文主要是針對上述LSPR傳感器系統芯片制備過程繁瑣、制備與檢測相互孤立等缺點，將電化學沉積法應用于LSPR芯片的制備，設計一種操作簡單、小型化的原位制備LSPR芯片和用于檢測的一體化的免標記LSPR生物傳感器裝置。

1 傳感器的設計與實現

1.1 基本原理

LSPR是Au,Ag,Pt等貴金屬納米粒子傳感性質的一種光譜表現形式，金屬納米粒子表面大量活躍的自由電子被入射光照射，發生集體振蕩，當入射光頻率與自由電子集體振蕩頻率相當時，產生共振，入射光被強烈吸收，在紫外可見光光譜上表現為出現明顯的特征吸收峰。研究表明，納米粒子的組成、尺寸、形狀和周圍介質折射率等因素均會影響LSPR性質[10]。LSPR傳感器即是利用Ag納米粒子的LSPR對外圍介質變化的敏感性制備的。通過計算機采集光譜數據，并進行處理分析，獲得所需信息，達到檢測目的。

1.2 系統結構

原位制備檢測LSPR生物傳感器分為兩部分:芯片電沉積系統;原位檢測系統(如圖1)。芯片電沉積系統由電化學工作站組成；原位檢測系統由光源系統、傳感系統、光譜分析系統和數據處理系統組成，光源系統由氘燈和鎢燈提供紫外光和可見光光源，傳感系統由光學樣品流動池組成，光譜分析系統由光譜儀組成，數據處理系統由電腦和相關處理軟件組成。其中，傳感系統是整個傳感器的核心部分，也是整合制備和檢測的關鍵部分。

圖1 傳感器芯片原位制備與檢測裝置結構示意圖

圖2是傳感系統中光學樣品流動池的半剖結構圖，光纖連接裝置連接光纖和樣品流動池，芯片插入芯片插口，覆蓋墊圈，光纖接口裝置在螺紋中緩慢推移芯片，使芯片與墊圈完全接觸密封，樣品池為圓柱形，樣品池的另一端為石英玻璃，整個樣品池空間密封，在石英片與另一光纖連接裝置之間有一段空白區域，防止光纖連接裝置擠壓石英片影響密封，另一光纖連接裝置也與光纖相連。樣品由蠕動泵勻速進樣，從進樣口進入流動池，出樣口流出，進樣通道與樣品池下底面相切，Pt絲電極與進樣通道相接觸，Pt絲設計為螺旋狀，以增加接觸面積。出樣通道與樣品池頂部相切，甘汞電極與出樣口相接觸。另有2個圓柱形塞子，可在不使用Pt絲電極與甘汞電極時替代電極，密封樣品池空間。樣品池厚度僅為3 mm，有效地縮短了光程。

圖2 光學樣品流動池半剖結構圖

1.3 系統檢測

LSPR生物傳感器芯片原位制備檢測的過程如圖3所示。一般選擇氧化銦錫(indium tin oxide,ITO)導電玻璃做基底芯片，先以基底芯片在水中的光譜線做參比，然后通入電解液，在一定條件下電沉積法在ITO層表面自組裝納米粒子，并測得吸光光譜圖，做基準值。如果只是簡單地測周圍介質折射率的改變，可直接通入不同折射率的溶液，記錄吸光光譜的變化即可；如果做復雜的蛋白質、DNA、生物小分子等的檢測，待檢測物與納米粒子無法直接作用，則需要進一步地修飾LSPR芯片表面來達到檢測的目的。最后由相關的光譜分析軟件實時記錄和分析所得數據。整個過程制備檢測一體化，實時快速便捷，無需移動，有效地減少了繁瑣的步驟和移動帶來的干擾。

圖3 LSPR生物傳感器芯片原位制備與測試過程示意圖

該LSPR生物傳感器也適用于傳統的先制備好芯片后進行檢測，只需使用另外的2個圓柱形塞子代替Pt絲電極和甘汞電極密封樣品池空間，其余步驟類似。整個檢測過程中，芯片位置不需要移動，同樣地顯示出其原位檢測的優點。

2 實驗測試

2.1 實驗步驟

本實驗選用ITO層厚度為25±5 nm的ITO導電玻璃。將ITO導電玻璃切割成120 mm×20 mm的長方形，在丙酮、乙醇、超純水中分別超聲清洗10 min，氮氣吹干。將清洗好的ITO導電玻璃安裝在LSPR傳感器裝置中，導電的一面朝向樣品流動池。通入含2 mmol/L AgNO3和0.5 mol/L H2SO4的水溶液電解液，Pt絲做對電極，甘汞電極做參比電極，使用電化學工作站在一定的電壓下電沉積60 s，制得LSPR芯片，然后依次通入0 %(n=1.333)，10 %(n=1.347 9)，20 %(n=1.363 9)，30 %(n=1.381 1)，40 % (n=1.399 7)和50 % (n=1.420 0)質量分數的蔗糖溶液(n表示折射率)，記錄其吸光光譜，檢測其對于周圍介質折射率的敏感度。

2.2 實驗結果與討論

對ITO導電玻璃在依次在-1.2，-1.4,-1.6 V條件下電化學沉積60 s，并通入上述不同質量分數梯度的蔗糖溶液，得到的吸光光譜。其中在-1.4 V電位下制備的LSPR芯片在不同質量分數蔗糖溶液中的吸光光譜如圖4所示。對吸光光譜圖進行分析，得到峰位移敏感度和吸光度敏感度(表1)。ITO層厚度為23±5 nm的ITO玻璃，在電化學沉積電位為-1.2 V時，相對周圍介質折射率的峰位移敏感度為238 nm/RIU，在-1.4，1.6 V時，峰位移敏感度分別為246，257 nm/RIU。由此可見，在同一ITO厚度層的條件下，當電化學沉積電位在負方向由1.2 V增大到1.6 V時，LSPR峰所處波段的紅移相對于周圍折射率變化增大，Ag納米自組裝LSPR芯片對周圍介質折射率響應增大。

圖4 ITO導電玻璃在-1.4 V電位下電化學沉積60 s

LSPR峰的吸光度數值的變化與周圍介質折射率的變化呈線性關系也表現了電化學沉積法自組裝的Ag納米LSPR對于周圍介質折射率的響應。ITO層厚度為23±5 nm的ITO玻璃，電化學沉積電位在負方向依次增大時，LSPR峰的吸光度數值相對周圍介質折射率的敏感度分別為-0.58，-0.65，-0.32 nm/a。電化學沉積電位為-1.4 V時，吸光度靈敏度最高。厚度為23±5 nm的ITO玻璃，電化學沉積電位為-1.4 V時，表現出的246 nm/RIU的折射率靈敏度比已報道的Ag納米球的折射率靈敏度要高[11]，此條件下所制得的LSPR芯片性能最好。

表1 ITO玻璃在不同電化學沉積電位下自組裝的LSPR芯片相對于周圍介質折射率的峰位移敏感度和吸光度敏感度

3 結 論

本文與電化學法相結合，設計了芯片制備和檢測一體化的LSPR生物傳感器。該裝置具有小型化、易操作、檢測結果實時化等特點，具有廣闊的商業化前景。研究了不同電化學沉積電位對自組裝Ag納米粒子LSPR芯片的影響，厚度為23±5 nm的ITO玻璃，電化學沉積電位為-1.4 V時，制得的LSPR芯片折射率靈敏度為246 nm/RIU，高于已報道的Ag納米球折射率靈敏度。

參考文獻:

[1]張建碧.基于MEMS的硅微壓阻式加速度傳感器設計[J].電子與封裝,2009,9(10):39-41.

[2]曾祥華,楊 軍,田 浩,等.一種小型化SPR生物傳感器的設計與實現[J].傳感器與微系統,2013,32(4):109-112.

[3]張曉鋒.LSPR生物傳感器的制備與測試[D].天津:南開大學,2011.

[4]Wang Zhenxin,Le’vy R,Fernig D G,et al.Kinase-Catalyzed modification of gold nanoparticles:A new approach to colorimetric kinase activity screening[J].Journal of American Chemical So-ciety,2006,128(7):2214-2215.

[5]Nath N,Chilkoti A.A colorimetric gold nanoparticle sensor to interrogate biomolecular interactions in real time on a surface[J].Analytical Chemistry,2002,74(3):504-509.

[6]Frederix F,Friedt J M,Choi K H,et al.Biosensing based on light absorption of nanoscaled gold and silver particles[J].Analytical Chemistry,2003,75(24):6894-6900.

[7]Kreuzer M P,Quidant R,Badenes G,et al.Quantitative detection of doping substances by a localised surface plasmon sensor[J].Biosensors and Bioelectronics,2006(21):1345-1349.

[8]Kreuzer M P,Quidant R,Salvador J P,et al.Colloidal-based localized surface plasmon resonance(LSPR)biosensor for the quantitative determination of stanozolol[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2008,391(5):1813-1820.

[9]Lee K S,El-Sayed M A.Gold and silver nanoparticles in sensing and imaging:Sensitivity of plasmon pesponse to size, shape, and metal composition[J].Journal of Physical Chemistry B,2006,110(39):19220-19225.

[10] Doremus R H.Optical properties of small silver particles[J].The Journal of Chemical Physics,1965,42(1):414-416.

[11] Mock J J,Smith D R,Schultz S.Local refractive index dependence of plasmon resonance spectra from individual nanoparticle-s[J].Nano Letters,2003,3(4):485-491.