不同品種小麥葉片對拔節期低溫的生理響應及抗寒性評價

姜麗娜，張黛靜，宋 飛，劉 佩，樊婷婷，余海波，李春喜

(河南師范大學生命科學學院， 新鄉 453007)

低溫冷(凍)害是黃淮海麥區頻發的自然災害之一，嚴重影響并制約著小麥的生長發育及產量的形成[1-2]。低溫脅迫后，植物體通過形態結構、內含物質和光合作用等一系列復雜的生理生化變化，對低溫環境進行響應[3-6]。研究表明，植物的抗寒性與細胞膜的流動性[7]、膜脂過氧化程度[8-9]、抗氧化酶活性[9-11]、滲透調節物質含量[12-13]密切相關。植物抗寒性是多基因控制的數量性狀，單一的生理指標難以全面準確反映抗寒性的強弱，可結合與抗寒性有關的多個指標，利用隸屬函數法[14-15]、加權法[16]、模糊評判法[17]、極點排序法[18]等進行抗寒性評價。其中，加權法和模糊評判法需要人為確定指標的權重值，而權重值的大小直接影響評判的結果。隸屬函數法是根據模糊數學原理，計算的隸屬函數值是多項指標綜合的結果，能比較準確地反映出品種間的抗寒性差異，在小麥[14]、果桑[15]、甘蔗[19]、葡萄[20]等均有應用。極點排序法，是將與抗寒性相關的多個指標進行權重分配，通過矩陣復合運算獲得綜合評價結果，已在甘蔗[18]、辣椒[21]、黃瓜[22]等進行了應用，而在小麥抗寒上未見報道。本文以黃淮海麥區參加區試的24個小麥品種為材料，在人工氣候室模擬拔節期低溫，分析其對葉片生理的影響。以低溫脅迫后各性狀的相對值作為抗寒性評價指標[14,23]，通過隸屬函數法和極點排序法對參試品種抗寒性進行鑒定，以篩選應對春季低溫脅迫的抗寒性品種及抗寒性鑒定指標，為增強黃淮海區域小麥減災抗災能力提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

供試小麥品種及其供種單位如表1所示。

表1 參試小麥品種的編號、名稱以及供種單位

2010年10月24日在河南師范大學網室進行盆栽種植。各品種選取完整無損、大小均勻的小麥籽粒，播入米氏盆(h19cm×φ23cm)中，每盆裝土2.5kg，播種30粒。隨機排列，每品種4盆。三葉期每盆定苗15株，常規管理。于2011年4月5日將低溫組(每品種2盆)移入人工氣候室中，16℃晝(16h，12000lx)/ 10℃夜條件下正常生長1d，然后在4℃晝(16h，12000lx)/ 4℃夜低溫條件下連續處理3d。對照組(每品種2盆)仍在網室中正常生長，環境溫度如圖1所示。處理結束后，分別取低溫和對照各品種小麥的倒一葉用于生理指標的測定，每品種重復2次。

圖1 對照組環境溫度

1.2 測定方法

相對電導率采用電導率儀法[24]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[24]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250比色法[24]，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸浸提-酸性茚三酮顯色法[25]，丙二醛(MDA)含量采用TBA比色法[26]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT比色法[24]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚比色法[27]。

1.3 數據分析

1.3.1 性狀相對值

以公式1[15]計算性狀相對值xj作為評價品種抗寒性的指標:

相對值(xj)=(低溫處理下某一指標測定值/對照測定值)×100%

(1)

1.3.2 相對性狀的隸屬度值

以公式2和公式3計算各品種相對性狀的隸屬度值[14-15]。其中，與抗寒性呈正相關的各指標(可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量及SOD活性、POD活性)隸屬度值以公式2計算，與抗寒性呈負相關的各指標(MDA含量和相對電導率)隸屬度值以公式3計算。

每一品種相對性狀隸屬度值的平均數即為該品種的平均隸屬度值:

U(xij)=(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)

(2)

U(xij)=1-(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)

(3)

式中，U(xij)為i品種j指標的隸屬函數值，xij為i品種j指標的相對值，xjmin和xjmax為各品種j指標相對值的最小值和最大值。

1.3.3 綜合排序值

(1) 將指標相對性狀值劃分為5級，每一指標的得分級差(每得1分之差)記為D，以公式4計算各相對指標的得分級差Dj[18]。

Dj=(xjmax-xjmin)/5

(4)

(2) 對每一品種所測指標相對值進行分級，使每一品種的每一指標都得到相應級別值Eij。當指標與抗寒性呈正相關時，該指標的Eij值以公式5計算；當指標與抗寒性呈負相關時，該指標的Eij值以公式6計算:

Eij=[(xij-xjmin)/Dj]+1

(5)

Eij=5-[(xij-xjmin)/Dj]+1

(6)

(3) 指標權重系數Bj為每一指標在綜合評價中的權重，以公式7進行計算:

Bj= 某一指標的變異系數/各指標變異系數之和

(7)

(4) 每一品種綜合排序值Vi以公式8進行計算:

Vi=∑Eij×Bj

(8)

1.3.4 統計分析

利用Microsoft Excel 2003和SPSS 13.0進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 拔節期低溫對小麥葉片生理指標的影響

2.1.1 相對電導率

正常生長條件下，參試的24個小麥品種葉片相對電導率平均為(23.08±3.99)%(圖2)，品種間差異極顯著(P<0.01)，以山農05-066(12號)葉片相對電導率表現最低，石麥19(1號)最高。低溫處理后，葉片電解質外滲增加，相對電導率極顯著高于對照(P<0.01)。低溫處理后，不同品種小麥葉片相對電導率的極差值增加，變異系數沒有明顯變化。與對照相比，在供試的24個品種中，山農05-066(12號)葉片相對電導率增幅最高(291.68%)，而石麥19(1號)增幅最低，僅為72.63%。

圖2 低溫脅迫下不同小麥品種葉片相對電導率

2.1.2 可溶性糖含量

對照組葉片可溶性糖含量為(18.05±4.41) mg/g干重(圖3)，品種間差異極顯著(P<0.01)。低溫促進了小麥葉片可溶性糖的積累，低溫處理后小麥葉片可溶性糖含量平均為(25.40±5.89) mg/g干重，極顯著高于對照(P<0.01)，且不同品種間極差值增加，而變異系數沒有明顯變化。與對照相比，良星619(15號)葉片可溶性糖含量增加了97.80%，而石06-6136(6號)僅增加了4%。

2.1.3 可溶性蛋白含量

對照組小麥葉片可溶性蛋白含量平均為(6.09±1.98) mg/g鮮重(圖4)，品種間差異極顯著(P<0.01)。低溫處理后葉片可溶性蛋白含量為(2.65±1.35) mg/g鮮重，極顯著低于對照(P<0.01)，且品種間可溶性蛋白含量極差值亦低于對照，而品種間變異系數高于對照。與對照相比，石4185(8號)葉片可溶性蛋白含量降低幅度最高(86.73%)，而山農05-066(12號)僅降低了5.58%。

2.1.4 游離脯氨酸含量

對照組小麥葉片游離脯氨酸含量平均為(131.36±73.70) μg/g鮮重(圖5)，品種間差異極顯著(P<0.01)。低溫處理后，葉片游離脯氨酸含量增加，平均為(236.33±96.19) μg/g鮮重，極顯著高于對照(P<0.01)，其品種間極差值亦高于對照，而變異系數低于對照。與對照相比，良星619(15號)葉片脯氨酸含量增加了350.43%，石4185(8號)僅增加了0.39%。

圖3 低溫脅迫下不同小麥品種葉片可溶性糖含量

圖4 低溫脅迫下不同小麥品種葉片可溶性蛋白含量

圖5 低溫脅迫下不同小麥品種葉片游離脯氨酸含量

2.1.5 MDA含量

對照組小麥葉片MDA含量平均為(1.06±0.29) μmol/g鮮重(圖6)，品種間差異極顯著(P<0.01)。低溫處理后，葉片MDA含量平均值為(1.68±0.46) μmol/g鮮重，極顯著高于對照(P<0.01)，且品種間極差值高于對照，而變異系數無明顯變化。與對照相比，石優20(2號)葉片MDA含量增加了318.32%，而石H083-363(3號)僅增加了10.34%。

圖6 低溫脅迫下不同小麥品種葉片MDA含量

2.1.6 SOD活性

對照組葉片SOD活性平均為(278.27±70.61) U/g鮮重(圖7)，品種間差異極顯著(P<0.01)。低溫處理后，葉片SOD活性為(349.75±45.96) U/g鮮重，極顯著高于對照(P<0.01)，且品種間極差值和變異系數均低于對照。與對照相比，石H083-363(3號)葉片SOD活性增加了171.85%，而徐麥4036(19號)僅增加了1.74%。

圖7 低溫脅迫下不同小麥品種葉片SOD活性

2.1.7 POD活性

對照組葉片POD活性平均為(59.57±22.83) U/g鮮重(圖8)，品種間差異極顯著(P<0.01)。低溫處理后，葉片POD活性為(103.50±40.88) U/g鮮重，極顯著高于對照(P<0.01)，且品種間極差值高于對照，但變異系數未有明顯變化。與對照相比，B07-4056(5號)增加了388.29%，而山農05-066(12號)僅增加了10.00%。

圖8 低溫脅迫下不同小麥品種葉片POD活性

2.2 拔節期低溫處理后小麥葉片相對性狀值

計算各指標的相對性狀值列于表2。低溫脅迫后，相對電導率的相對值和相對脯氨酸含量較高，平均值達到253.27%和223.47%，其次是相對POD活性和相對MDA含量，而相對可溶性蛋白含量較低。從各性狀相對值的變異系數來看，相對脯氨酸含量、相對可溶性蛋白含量、相對POD活性的變異系數較高，均高于50%，其次是相對MDA含量和相對SOD活性。

表2 各品種相對性狀值/%

x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7分別表示相對電導率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性和POD活性的相對值

2.3 抗寒性評價

根據相對性狀值，計算參試品種的平均隸屬度值為0.19—0.63，綜合排序值為1.66—4.08(圖9)。平均隸屬度值和綜合排序值高，該品種的抗寒性強；反之，該品種的抗寒性弱。根據平均隸屬度值和綜合排序值對參試品種進行排序，結果不完全相同，二者均以良星619表現最高，石優20表現最低。

以平均隸屬度值和綜合排序值對參試品種進行K-Means聚類，經過4次聚類迭代后將參試品種聚為5類，各類中心值列于表3。第Ⅰ類綜合排序值和平均隸屬度值均較高，抗低溫能力最強；第Ⅴ類綜合排序值和平均隸屬度值均較低，抗低溫能力最弱。

圖9 各品種的平均隸屬度值和綜合排序值及其聚類類別

表3聚類分析中的各類中心

Table3Clustercentersinclusteranalysis

聚類ClusterⅠⅡⅢⅣⅤ綜合排序值Comprehensive score3.873.322.872.321.77平均隸屬度值Average of SF0.570.490.370.310.20

各品種的聚類類別如圖9所示。良星619、豐德存麥1號、B07-4056、石H083-363、山農055843和良星99等6個品種聚在第Ⅰ類，其抗寒性最強；宿553、陜農509、A-9、中原6號、徐麥4036、舜麥1718和石麥19等7個品種聚在第Ⅱ類，其抗寒性強；堯麥16、C-44、山農05-066、冀麥585和石B05-7388等5個品種聚在第Ⅲ類，其抗寒性中等；偃展4110、B-33、B05-6507和石4185等4個品種聚在第Ⅳ類，其抗寒性弱；石06-6136和石優20這2個品種聚在第Ⅴ類，其抗寒性最弱。

表4 各相對性狀的相關分析

*表示相關性達顯著性水平(P<0.05)，**表示相關性達極顯著水平(P<0.01); CS表示綜合排序值，ASF表示平均隸屬度值

從相關關系來看(表4)，平均隸屬度值和綜合排序值與葉片相對可溶性糖含量、相對脯氨酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與葉片相對POD活性呈顯著正相關(P<0.05)，與葉片相對MDA含量呈顯著負相關(P<0.05)。二者與相對可溶性蛋白含量和相對SOD活性呈正相關，與相對電導率呈負相關。

從各品種的相對性狀值來看(表2)，良星619(15號)葉片相對可溶性糖含量和相對脯氨酸含量均最高，其平均隸屬函數值和綜合排序值亦排在首位，抗寒性最高。石H083-363(3號)葉片相對MDA含量最低，相對SOD活性最高，其隸屬函數值和綜合排序值分別為0.604和3.763，抗寒性屬于第I類；B07-4056(5號)葉片相對POD活性遠高于其它品種，其隸屬函數值和綜合排序值分別為0.566和3.837，抗寒性亦屬于第I類。石優20(2號)葉片相對MDA含量遠高于其它品種，其隸屬函數值和綜合排序值分別為0.192和1.661，其抗寒性最弱；石06-6136(6號)葉片相對可溶性糖含量和相對SOD活性較低，而石4185(8號)葉片相對可溶性蛋白含量和相對脯氨酸含量均最低，這2個品種的抗寒性均弱，僅略高于石優20(2號)。

3 討論

拔節期是小麥快速生長時期，亦是對低溫敏感的時期[14]。低溫脅迫下，植物細胞發生一系列生理生化變化以適應和進行自我調節[4-6]。生物膜是植物細胞與外界環境之間發生物質交換的通道，各種逆境對植物細胞的影響首先作用于生物膜，常以葉片電導率作為鑒定細胞膜透性以及破壞程度的重要指標[7,28]。本研究表明，拔節期低溫脅迫后小麥葉片相對電導率較對照增加。因此，低溫脅迫使小麥葉片生物膜透性增加并且膜受損程度加大。

低溫脅迫下可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸等滲透調節物質的含量發生變化，植物可通過調節滲透濃度來啟動脫落酸的形成，誘發蛋白質的合成，增加抗寒性[9]。本研究表明，拔節期低溫脅迫后，葉片可溶性糖含量和游離脯氨酸含量較對照增加，在一定程度上可以促進蛋白質的合成，但葉片中可溶性蛋白含量仍表現為低于對照。

低溫脅迫下，植物體內產生大量的活性氧自由基，引發膜脂過氧化[8]，產生膜脂過氧化產物MDA，且膜脂過氧化的程度隨溫度降低和脅迫時間延長而加重[9]，同時植物體內還存在著SOD、POD等抗氧化酶系統以清除活性氧、降低逆境損傷[9-11]。本研究表明，拔節期低溫脅迫下，小麥葉片SOD活性、POD活性和MDA含量均高于對照。SOD活性和POD活性的增加可以減輕低溫對生物膜的迫害，說明植株對低溫產生了一定的響應。但是MDA含量的增加顯示低溫脅迫后葉片膜脂過氧化程度仍然呈現增高趨勢。

不同小麥品種抗低溫能力差異很大[8,14,24,26-27,30-31]。有研究表明，低溫脅迫下小麥葉片MDA含量[8,14]、可溶性蛋白含量[8]下降，電導率[29]、SOD活性[6,29]、POD活性[6]、可溶性糖含量[14]的變化存在品種間差異或變化不明顯。這主要是由于品種特性、脅迫溫度強度、脅迫持續時間及小麥所處生育期不同而致。本研究表明，拔節期低溫脅迫后，小麥葉片相對電導率、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、MDA含量、POD活性品種間極差值均高于對照，而可溶性蛋白含量和SOD活性品種間極差值低于對照，不同品種間各指標的增加(減少)量存在較大差異。計算各指標的相對性狀值，則可以消除品種自身遺傳特性的影響[8,14-15]。本研究表明，低溫脅迫后，相對電導率的相對值以及相對脯氨酸含量較高，而相對可溶性蛋白含量較低。由相對性狀值，通過隸屬函數法和極點排序法，計算出各品種的平均隸屬度值和綜合排序值，并通過K-means聚類，將參試品種聚成了5類。其中，良星619抗低溫能力最強，而石優20抗低溫能力最弱。

有關小麥抗寒性的評價指標，已有研究并不完全一致。劉艷陽研究認為SOD活性、MDA含量可以作為小麥抗寒性的評價指標[6]，高志強認為電導率和可溶性糖含量是衡量小麥抗寒性較好的指標[28]。本研究相關分析表明，葉片相對可溶性糖含量、相對脯氨酸含量、相對POD活性與相對MDA含量與平均隸屬度值和綜合排序值相關關系顯著，認為這4個指標可以作為拔節期小麥抗寒性鑒定的主要評價指標。

本研究僅從葉片生理響應上分析了拔節期低溫對小麥植株生長的影響，而小麥的抗寒性不僅包含自身的遺傳因素和生理特征，更與外界環境因素密切有關。選育抗寒性強的品種、建立良種良法配套的高產栽培技術，提高小麥的抗寒綜合能力，是目前小麥安全高效栽培生產中亟待解決的問題。

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