核盤菌侵染對擬南芥表皮蠟質結構及化學組成的影響

倪 郁，宋 超，王小清

(西南大學農學與生物科技學院，重慶 400716)

植物表皮蠟質是指覆蓋在植物表皮細胞外的一層由親脂性化合物構成的疏水層，一般呈綠灰色、灰白色霜狀[1]。作為植物與環境的第一接觸面，具有特殊微晶體形態以及復雜化學組分的表皮蠟質可有效地協調植物與環境的關系。前人研究表明，植物蠟質具有很好的生態學功能[2-4]，例如，阻止植物組織的非氣孔性水分散失、防止植物被有害光線損傷、保護植物避免某些昆蟲的蠶食等功能。蠟質的物理和化學屬性是其生態學功能得以實現的基礎。在面對病原菌等生物環境因子脅迫時，一些植物葉片及水果表皮蠟質層的厚度和三維晶體結構可有效抵御真菌病原物的入侵[5-6]。植物表皮蠟質的含量及化學組成與植株抗病性的強弱密切相關[7-11]，表皮蠟質也因此被認為是抵御病原物的第一道屏障[12]。葉表面特性影響葉片潤濕性、孢子萌發管方向及病菌從氣孔侵入[13]。大麥(Hordeumvulgare)葉表皮蠟質誘導了布氏白粉菌(Blumeriagraminis)附著胞的分化，而非寄主植物葉蠟的誘導效果則很小；大麥葉蠟組分C26醛是誘導布氏白粉菌(Blumeriagraminis)附著胞分化的主要因子[14]。智利大麥(Hordeumchilense)、東部白松(Pinusstrobus)等葉片氣孔被角質層蠟質覆蓋后，阻止了病原菌從氣孔侵入[13,15]。玫瑰抗黑斑病的強弱與葉表皮蠟質中的烷和脂類物質有關[9]；擬南芥蠟質突變體sma4/lacs2由于角質層膜透性的改變使得植株體內抗真菌物質可以更快地釋放到植物表面而表現出對灰霉菌(Botrytiscinerea)的抗性增強[16]。這些研究通過對植物蠟質特性的分析不同程度地解釋了表皮蠟質影響真菌侵染的作用機制，但真菌病原物侵染對植物表皮蠟質物理結構及化學組成的影響還不清楚。近年來，隨著植物化學、分子遺傳學等相關學科的發展和滲透，植物蠟質的研究也得到進一步深入，其生態學功能也得到重新評估。擬南芥作為研究遺傳學和分子生物學的一種模式植物，具有典型的角質層結構及組分。其角質層結構主要由3層組成：最外層的蠟質層(EW)、真角質層(CP)和角化層(CL)[3]。蠟質主要由可溶性的超長鏈脂肪酸、烷烴、一級醇、二級醇、脂肪醛、酮類、酯類等組成，并具有特定的晶體形態。因此擬南芥也常被用作角質層蠟質研究的模式材料。

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)是世界上破壞性最強的植物病原物之一，引起的菌核病是導致許多作物減產的主要病害。實驗室前期研究工作發現S.sclerotiorum侵染甘藍型油菜(BrassicanapusL.)后，抗性品種表皮蠟質中的烷類、醛類顯著增加[17]。為了揭示病原物侵染對植物表皮蠟質的影響機制以及如何突破表皮蠟質這一屏障，本試驗以擬南芥野生型以及蠟質缺失突變體cer1、cer4為試驗材料，從蠟質的晶體形態以及化學組分的變化來分析植物蠟質在S.sclerotiorum脅迫下的表現，以期進一步闡明植物表皮蠟質與病原物的互作機制，為生產實踐中通過改變植物表面特征而改良植物抗病性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

哥倫比亞野生型(Col-0) 擬南芥種子為西南大學植物生理生化研究室保存，表皮蠟質突變體cer1(蠟質中烷、次級醇、酮含量減少)、cer4(蠟質中一級醇含量減少)種子均購于擬南芥資源中心(ABRC，USA)。將蛭石、珍珠巖和有機土按1∶1∶1的比例混勻后裝入花盆(直徑7 cm×高度8 cm)，將低溫春化后的種子播在花盆中，每盆4 株，然后用塑料薄膜覆蓋5 d以利于出苗。試驗材料放置在人工氣候培養箱中培養，光照強度為125 mmol m-2s-1，溫度為21 ℃/23 ℃(黑夜/白天)，光照每天16 h，空氣濕度為75%。待植株生長至5—6 周時進行核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)接種，以不接種為對照。

1.2 核盤菌培養及接種方法

核盤菌菌核分離自油菜病株，經表面消毒后在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上培養。病菌培養參考臧憲朋等[18]方法，先活化核盤菌菌，即從核盤菌平板菌落外緣用滅菌的打孔器切取直徑為6 mm的菌絲塊，移至新PDA培養基平板中央，在25 ℃培養箱內活化培養2 d，然后以同樣方法再次轉接到新的PDA平板上培養，3 d后從菌落邊緣新生的菌絲中用滅菌的打孔器取直徑為6 mm的菌絲塊，按10 塊/100 mL加入到PDA液體培養基中，在25 ℃、150—200 r/min下振蕩培養4—6 d，待培養基中充滿細小菌絲時，用組織勻漿機粉碎，制成菌絲懸浮液并將濃度調至OD600值為1.0，進行噴霧接種。接種后調節空氣濕度大于90%培養擬南芥植株，接種72 h后取樣進行蠟質結構及組分分析。以噴施不含核盤菌的PDA液體培養基為對照。

1.3 表皮蠟質結構的掃描電鏡觀察

在預試驗及相關文獻報道[1]中，擬南芥葉片在電鏡觀察下無明顯蠟質晶體結構，且蠟質含量遠遠低于莖稈，因此本試驗所用材料除特殊說明外均為擬南芥莖稈。分別取對照與接種處理的擬南芥植株，將其干燥后剪取中部1 cm長莖段，貼于電鏡載物臺上，進行離子濺射鍍金后在掃描電鏡(S3000-N，Hitachi)下觀察、拍照。每處理3 個重復。

1.4 表皮蠟質的提取

分別從對照與接種處理材料蓮座葉根部剪下擬南芥莖桿，去莖生葉及種莢。將整株莖稈放入含有10 mL氯仿的試管中浸提30 s，以提取表面蠟質，氯仿中加入C16烷作為內部標準。氮吹儀吹干浸提液，在100 ℃下用80 μL BSTFA衍生20 min，再經氮氣吹干后，溶于200 μL正己烷中，進行色譜-質譜分析。每3 株莖稈為一個重復用于提取表面蠟質，每處理3 個重復。

1.5 表皮蠟質組分及含量的GC-MS分析

擬南芥表皮蠟質組成及含量利用氣相色譜-質譜聯用儀(GCMS-QP2010 plus)進行分析測定。程序升溫方式：初溫80 ℃，保持2 min；每分鐘15 ℃升溫至260 ℃，保持10 min。然后每分鐘10 ℃升溫至320 ℃，保持5 min。基于FID峰值量化蠟質，根據內部標準物(C16烷)的濃度計算各蠟質組分含量。蠟質含量用單位面積上的微克數(μg/cm2)進行表示。莖桿面積測定采用數字化掃描儀(EPSON V750)和WinFOLIA專業葉片圖像分析系統(Regent Instrument Inc, Canada)進行分析并記錄。

1.6 數據分析

采用SPSS13.0軟件分析接種核盤菌對擬南芥莖表皮蠟質組分含量的影響。顯著水平為P<0.05(LSD檢驗)。

2 結果與分析

2.1 擬南芥對核盤菌的感病性

將核盤菌噴霧接種24 h后，擬南芥野生型及各突變體材料葉片、莖稈不同程度地變褐，其中cer4突變體發病較輕。噴霧接種72 h后，所試材料均整株發病而呈現枯黃。

2.2 核盤菌脅迫下擬南芥蠟質晶體結構的變化

擬南芥莖稈表面分布有不同類型的蠟質晶體。掃描電鏡顯示，野生型(WT)擬南芥蠟質晶體分布密度高，晶體類型以垂直于表面的桿狀、塊狀結構為主(圖1a,b)。接種核盤菌后，野生型擬南芥桿狀蠟質晶體顯著減少，蠟質晶體呈現出似融入表皮的趨勢，晶體邊界模糊，表皮凹凸不平，呈“囊狀凸起”；部分區域表皮呈“撕裂” 狀(圖1c—f)。表皮蠟質突變體cer1與野生型相比，蠟質晶體分布密度顯著減少，體積變小，晶體類型以水平的松針狀、塊狀結構為主(圖2a,b)。接種處理后，突變體cer1莖稈表面可觀察到縱橫交錯的菌絲(圖2c)，松針狀結構顯著減少或消失，其余蠟質晶體邊緣變得模糊，晶體結構呈現出與野生型接種處理后相似的變化，部分區域表皮呈“囊狀凸起”或“撕裂” 狀(圖2d—f)。突變體cer4蠟質晶體表現出與野生型完全不同的結構，晶體類型以垂直片層結構為主(圖3a,b)。接種處理后，突變體cer4晶體分布密度減少，部分區域垂直片層結構消失，表皮凹凸不平，呈“囊狀凸起”(圖3c—e)。

2.3 核盤菌脅迫下擬南芥表皮蠟質組分的變化

本試驗中，擬南芥被檢測到的表皮蠟質組分主要有一級醇類、醛類、酸類、烷類、次級醇類及酮類，其中烷類在蠟質總量中所占的比重最高(34%—58%)。與野生型相比，cer1突變體表皮蠟質中醛、烷、次級醇和酮含量以及蠟質總量均顯著減少；cer4突變體表皮蠟質中一級醇水平顯著下降。接種核盤菌后，野生型擬南芥與蠟質突變體cer1、cer4一級醇含量分別增加了152%、54%和883%，其中野生型與突變體cer4一級醇類增加顯著。各材料蠟質組分中烷類、次級醇類、酮類含量與蠟質總量在接種核盤菌后均顯著減少，烷類分別減少了35%(WT)、48%(cer1)、33%(cer4)。接種核盤菌后，酸類減少(cer1、WT)或無顯著變化(cer4)；醛類含量變化在各材料中不一致(圖4)。

圖1 核盤菌脅迫下野生型(WT)擬南芥莖表皮蠟質晶體結構的變化

圖2 核盤菌脅迫下擬南芥cer1突變體莖表皮蠟質晶體結構的變化

圖3 核盤菌脅迫下擬南芥cer4突變體莖表皮蠟質晶體結構的變化

圖4 接種核盤菌對擬南芥表皮蠟質組分含量及蠟質總量的影響

3 討論

前人研究表明，蠟質具有特殊的微晶體形態以及復雜的化學組分，這是其生態學功能得以實現的基礎，也為植物適應不同生境提供了保證[19]。外界非生物因素能夠影響植物表皮蠟質。柑桔在乙烯的誘導下表皮蠟質含量增加，蠟質結構發生變化[20]。紫花苜蓿葉表蠟質結構在低空氣濕度和水分脅迫下發生了不同程度的熔融變化[21]。擬南芥莖稈表面分布有不同類型的蠟質晶體，例如，野生型擬南芥垂直于表面的桿狀、塊狀晶體結構，突變體cer1的水平松針狀、塊狀結構，突變體cer4的垂直片狀結構。本研究表明生物因素也會影響植物表皮蠟質的特性。在核盤菌脅迫下，野生型擬南芥與蠟質突變體cer1分別表現出桿狀、松針狀蠟質晶體顯著減少；野生型與突變體cer1、cer4部分區域蠟質晶體均表現出熔入表皮趨勢，表皮凹凸不平而呈現出“囊狀凸起”現象，其中野生型與突變體cer1表皮膜層在這些“囊狀凸起”的某些區域呈“撕裂”狀。綜合擬南芥野生型與突變體的這些蠟質結構變化，暗示了蠟質結構在病菌脅迫下的變化模式可能為：桿狀等晶體減少，蠟質晶體熔融，表皮膜層“囊狀凸起”，最終表皮膜層破裂。核盤菌在附著胞形成后依靠巨大膨壓機械地穿透角質層及表皮細胞壁，而病菌一旦突破角質層及表皮細胞后，很快以分枝生長，遍布表皮及葉肉細胞[22]。核盤菌脅迫下擬南芥表皮蠟質晶體的減少以及表皮膜層的破裂將更有利于病菌侵入到植株體內。

有研究報道，擬南芥抗病基因PR1的表達與葉表皮蠟質層中部分蠟質組分密切相關[23]。紫花苜蓿(Medicagotruncatula)抗銹菌突變體irg1與野生型相比，其葉片下表皮蠟質晶體結構缺失，疏水性減少，蠟質組分中C30一級醇減少了90%以上，而C29、C31烷則顯著增加[24]。白粉菌(Erysiphe.pisi)在豌豆(Psiumsativum)葉片近軸端的出芽率高于遠軸端，蠟質組分分析結果表明，其葉片近軸端蠟質組分一級醇含量較高，而遠軸端組分以烷類為主[25]。本試驗中，野生型擬南芥中一級醇含量(0.582 μg/cm2)占自身蠟質總量的2.057%，突變體cer1和cer4一級醇含量(0.399，0.096 ug/cm2)分別占其自身蠟質總量的13.3%和0.51%。一級醇含量最低的cer4突變體在核盤菌脅迫下除部分區域表皮“囊狀”凸起外，晶體類型無顯著變化，也無表皮破裂現象。這部分地解釋了突變體cer4在接種早期相對較慢的發病進程。cer1突變體以及野生型擬南芥較高的一級醇含量可能與其受到核盤菌脅迫后表皮膜層的破裂有關。擬南芥各材料中烷類、次級醇類、酮類含量與蠟質總量在接種核盤菌后均顯著減少，這與掃描電鏡觀察到的蠟質晶體在受到病菌脅迫后減少的趨勢相符合。蠟質組分的變化說明核盤菌侵染對表皮蠟質的影響不僅僅是對結構的物理作用，同時在蠟質代謝層面也受到影響。而野生型擬南芥與蠟質突變體在接種后一級醇類含量的普遍增加是否與核盤菌侵染有關、以及蠟質化學組分的變化與晶體結構的相應關系還有待進一步研究。

在包括擬南芥在內的大多數植物中, 角質層蠟質生物合成主要通過脫羰基途徑與酰基還原途徑進行。在擬南芥中, 醛、次級醇、烷、酮等約80%的蠟質組分通過脫羰基途徑產生，而一級醇、酯類等約20%的蠟質組分由酰基還原途徑產生[26]。本研究中，擬南芥在受到病害脅迫后烷類、次級醇、酮類含量的減少以及一級醇含量的普遍增加暗示了蠟質前體物質在受到病害脅迫后更多地通過酰基還原途徑生成一級醇，從而減少了由脫羰基途徑所生成的蠟質組分。由于烷類物質在擬南芥蠟質總量中所占的比重最高(34%—58%)，因此即使一級醇含量增加，蠟質總量也因為烷類的減少而呈減少趨勢。研究結果顯示，生物逆境下擬南芥植株蠟質化學組分的變化可能是由于不利環境因子的作用改變了蠟質合成途徑，從而影響了蠟質組分的分泌量。

4 結論

核盤菌侵染能改變植物表皮蠟質的晶體結構及化學組分的分泌量，并以此來促進對表皮層的侵入。

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