北太平洋柔魚微衛星標記的篩選及遺傳多樣性

劉連為，陳新軍,2,3,*，許強華,2,3，李偉文

(1. 上海海洋大學海洋科學學院， 上海 201306； 2. 國家遠洋漁業工程技術研究中心，上海 201306；3. 上海海洋大學大洋漁業資源可持續開發省部共建教育部重點實驗室，上海 201306)

柔魚(Ommastrephesbartramii)廣泛分布于全球溫帶、副熱帶海域，目前被規模性開發利用的海域主要在北太平洋[1- 2]。根據不同的產卵季節與地理位置，北太平洋柔魚被劃分為冬春生西部群體、冬春生中東部群體、秋生中部群體與秋生東部群體[3]。其中，冬春生西部群體為我國大陸魷釣船的傳統捕撈對象，而秋生群體主要為原流刺網作業海域捕撈對象。柔魚資源量豐富，且在海洋生態系統中占據重要的地位，被認為是最重要的大洋性柔魚類之一[4]。國內外學者對柔魚漁業生物學[5- 6]、資源評估[7- 8]等方面進行深入的研究，有關其群體遺傳學的研究體現在不同的研究方法上。Katugin[9]運用蛋白質電泳技術檢測出北太平洋柔魚東西部群體由于等位基因頻率不連續分布產生的遺傳差異。而劉連為等[10]基于線粒體DNA標記研究了北太平洋柔魚種群遺傳結構，認為柔魚冬春生群體與秋生群體以及不同的地理群體之間不存在顯著的遺傳分化。作為漁業管理的基本單元，柔魚各群體間是否存在顯著的遺傳變異有待進一步研究。

微衛星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀重復序列，又稱簡單序列重復(simple sequence repeat，SSR)。SSR標記具有高度多態性、共顯性、實驗操作相對簡單等優點，使得它在群體遺傳學分析、基因克隆、育種改良以及連鎖圖譜構建等領域得到廣泛的應用[11]。目前，頭足類很多種類的微衛星標記已被分離、篩選，并應用到群體遺傳多樣性與種群遺傳結構研究中[12- 13]。而柔魚微衛星DNA的分離在國內外尚未見報道，本研究采用磁珠富集法篩選柔魚微衛星標記，并應用于群體遺傳多樣性檢測，以期為柔魚資源的可持續利用和科學管理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

柔魚樣本按照地理位置劃分為西北群體和東北群體，存放于船艙冷庫中并運回至實驗室。取套膜肌肉組織，置于95%乙醇中，保存于-20 ℃冰箱內。西北群體和東北群體分別由3個部分組成，命名為西北群體1(northwest population 1，NW1)、西北群體2(northwest population 2，NW2)、西北群體3(northwest population 3，NW3)與東北群體1(northeast population 1，NE1)、東北群體2(northeast population 2，NE2)、東北群體3(northeast population 3，NE3)。利用耳石微結構獲得的日齡數據并結合捕撈日期推算孵化時間，劃分出冬春生群體(NW1、NW2、NE1)和秋生群體(NW3、NE2、NE3)(表1)。限制性內切酶Sau3AI、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α購自寶生物工程(大連)有限公司。Biospin Gel Extraction Kit購自杭州博日科技有限公司，Dynabeads M- 280 Streptavidin為Invitrogen Dynal AS產品。探針(AG)12、(AC)12、接頭引物及微衛星引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 柔魚樣本采集信息

1.2 基因組DNA的提取

采用組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取DNA，洗脫緩沖液EB溶解，-20 ℃保存備用。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計檢測DNA濃度。

1.3 微衛星富集文庫的構建及微衛星標記的篩選

微衛星富集文庫的構建主要參考孫效文等[14]方法。限制性內切酶Sau3AI對基因組DNA進行酶切，Biospin Gel Extraction Kit回收250—1000 bp大小片段。基因組DNA片段與Brown接頭連接:

A：5′-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT

B：5′-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC

最后將富集的微衛星DNA片段經pMD19-T載體連接并轉化到大腸桿菌DH5α中，從而建立柔魚部分基因組文庫。挑選含有微衛星片段的陽性克隆進行測序，根據其核心序列兩端保守的側翼序列，用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計。PCR擴增篩選具有較高特異性與多態性的微衛星標記。

1.4 微衛星PCR擴增

PCR反應總體積為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL、TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL、DNA模板20 ng、ddH2O補足體積。PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃最后延伸2 min。PCR產物經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離、Biospin Gel Extraction Kit純化后，送至上海邁浦生物科技有限公司，通過ABI3730XL全自動DNA測序儀分析，以ROX- 500為分子量內標，通過Genemapper Version 3.5軟件讀取微衛星擴增產物的分子量數據。

1.5 數據統計與分析

根據分子量數據確定個體各位點基因型，利用POPGEN 3.2[15]進行群體遺傳學分析，計算等位基因數(Na)，有效等位基因數(Ne)，觀測雜合度(Ho)，期望雜合度(He)與Shannon多樣性指數(Shannon′s information index，I)。多態信息含量(PIC)由CERVUS 3.0[16]軟件計算，并采用馬爾科夫鏈(Markov Chain)方法進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。利用ARLEQUIN 3.5[17]計算群體遺傳分化的F-統計量(F-statistics，Fst)及分子方差分析(AMOVA)。利用POPGEN 3.2計算群體間的Nei′s遺傳距離，并基于該遺傳距離用MEGA 5.0[18]構建UPGMA系統發生樹。根據遺傳距離及地理距離數據在Excel中作線性相關圖，其中兩地理坐標間直線距離計算方法參照韓忠民[19]的方法。利用STRUCTURE 2.3[20]進行群體遺傳結構分析，分析最佳K值，即群體遺傳結構的理論群體數。

2 結果

2.1 微衛星序列特征

隨機挑取800個菌落，經菌落PCR檢測后，共有68個陽性克隆，陽性克隆率為8.5%。對所有的陽性克隆進行測序，有60個(88.24%)克隆含有微衛星序列(部分微衛星序列已提交到Genbank，Genbank登錄號為：KC855227—KC855255)。重復次數在11—20次間的34個(44.74%)，重復20次以上的微衛星32個(42.10%)，最高重復次數為33次。其中，完美型微衛星46個(60.53%)，非完美型微衛星28個(36.84%)，混合型微衛星2個(2.63%)(表2)。除探針使用的AC/TG、AG/TC重復外，還得到ACAG、AGAC重復序列。

表2 柔魚微衛星不同類型重復序列所占比例

2.2 微衛星位點的多態性及群體的遺傳多樣性

選擇合成的20對微衛星引物對柔魚30個個體進行PCR擴增，結果有12對能擴增出特異條帶，其中8對具有多態性，并應用于6個不同地理位置的柔魚群體遺傳學分析，引物的核心序列、產物大小及退火溫度等情況如表3所示。各位點在所有群體中的擴增結果見表4，等位基因數(Na)為44—52個，有效等位基因數(Ne)介于4.11—30.15之間；觀測雜合度(Ho)介于0.640—0.840之間，期望雜合度(He)介于0.747—0.969之間；多態信息含量(PIC)介于0.787—0.987之間，均為高度多態性位點(PIC>0.5)，Shannon多樣性指數(I)介于1.772—3.638之間。位點Bo103與位點Bo105極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。

6個不同地理位置的柔魚群體遺傳多樣性如表5所示。NW1群體的平均等位基因數最多(Na=25.13)，NW3群體最少(Na=15.00)；NW2群體的平均有效等位基因數最多(Ne=9.91)，NW3群體最少(Ne=7.96)；NE2群體的平均觀測雜合度最高(Ho=0.761)，NW3群體最低(Ho=0.672)；NW1群體的平均期望雜合度最高(He=0.851)，NE1群體最低(He=0.808)；NW1群體的多態性息含量最高(PIC=0.918)，NE3群體最低(PIC=0.779)。NW1群體的Shannon多樣性指數最高(I=2.571)，NW3群體最少(I=2.215)。總體上，6個不同地理位置的柔魚群體均具有較高的遺傳多樣性。

表3 柔魚8對微衛星引物特征

表4 柔魚8個微衛星位點多態性

表5 6個不同地理位置的柔魚群體遺傳多樣性

2.3 群體遺傳分化與遺傳結構分析

AMOVA分析顯示群體間遺傳差異主要來自于個體間，僅有0.56%的遺傳差異來自于群體間，遺傳變異不顯著(表6)。NW1群體與NE2群體間遺傳分化系數Fst為負值，說明兩群體間無遺傳分化。其余群體間遺傳分化系數介于0.0016—0.0244之間，屬于輕微程度的分化(Fst<0.05)，且統計檢驗不顯著，進一步表明群體間不存在顯著的遺傳差異。基于Nei′s遺傳距離(表7)的UPGMA聚類樹顯示，NE1群體與NE3群體聚為一族群，其余4個群體聚為一族群，且NW1群體與NE2群體首先聚在一起(圖1)。群體間的遺傳距離與地理距離相關性分析結果如圖2所示，二者沒有呈現出正相關性(R=0.175，P>0.05)。STRUCTURE 2.3軟件執行2—6的假設K值，重復次數為10次，根據K值對應參數的趨勢分析，推斷本研究所有參試個體最佳分組為1個理論群。

表6 柔魚群體分子方差分析

表7 柔魚群體間Nei′s遺傳距離(DA，對角線以下)及F統計值(Fst，對角線以上)

圖1 基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類樹

圖2 群體間Nei′s遺傳距離和地理距離的散點圖

3 討論與分析

本文以北太平洋傳統作業漁場柔魚為樣本對分離的微衛星位點進行多態性檢測，篩選出8個多態性位點(Ho=0.754)，所有樣本均擴增出條帶。應用這些微衛星位點對北太平洋6個不同地理位置的柔魚群體進行遺傳多樣性分析，平均每個微衛星位點獲得50.5個等位基因與17.08個有效等位基因，多態性信息含量均較高(PIC>0.5)，適用于柔魚群體遺傳學分析。位點Bo103與位點Bo105對NE1群體及NE3群體擴增時，部分樣本未擴增出條帶，個別樣本僅顯現小片段等位基因的條帶，造成該位點純合體個體過剩。Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示這2個位點極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，因此，2個位點很可能存在無效等位基因。無效等位基因產生的原因主要為微衛星側翼序列變異，從而導致該位點無法正常擴增[21]。而大片段等位基因丟失也會造成無效等位基因，這些在實驗結果中均體現出[22]。無效等位基因會對遺傳學相關研究結果造成顯著影響，在以后的實驗中可通過重新設計微衛星引物或者估算無效等位基因頻率進行群體遺傳學研究。

6個不同地理位置的柔魚群體平均觀察雜合度介于0.672—0.761，平均期望雜合度介于0.808—0.851，與太平洋褶柔魚(Todarodespacificus)和阿根廷滑柔魚(Illexargentinus)的雜合度相近，分別為Ho：0.200—0.950，He：0.644—0.950；Ho：0.59—0.93，He：0.62—0.96[23- 24]。因此，各群體顯示出較高的雜合性。Katugin[9]利用18個蛋白酶位點檢測北太平洋柔魚東西部2個群體的遺傳變異水平，只有1個蛋白酶位點顯示出明顯的遺傳差異及較高的雜合度(Ho=0.294，He=0.322)。東西部群體平均觀察雜合度分別為：0.060 ± 0.021與0.043 ± 0.022，平均期望雜合度分別為0.056 ± 0.020與0.043 ± 0.022，遠遠低于微衛星位點檢測的雜合度水平。蛋白質標記為基因表達的產物，所檢測到的遺傳差異水平很容易受到周圍環境的影響。劉連為等[10]利用線粒體標記檢測出北太平洋柔魚2個產卵季節群體具有較低的核苷酸多樣性水平。由此可見，微衛星標記應用于物種群體遺傳變異水平研究較其它分子遺傳標記有一定的優越性。

本研究所取樣本為東西部2個不同產卵群體，其中NW1、NW2、NE1群體為冬春生群體，NW3、NE2、NE3群體為秋生群體。兩兩群體間的Fst值與AMOVA分析結果顯示，群體間的遺傳分化程度較低，未達到顯著性水平，遺傳差異主要存在于個體間。6個群體UPGMA聚類分析顯示，NE1群體和NE3群體親緣關系最近，聚為一類，而地理位置相距較遠的NW1群體與NE2群體親緣關系最近，另聚為一類，而且它們屬于不同的產卵季節群體。群體間的遺傳距離與地理距離相關性結果進一步說明了不同地理群體間的親緣關系遠近與地理距離不成正相關性。北太平洋海域缺乏顯著的地理障礙，而且柔魚個體具有較強的游泳能力，在海流的作用下，群體之間存在較強的基因交流[25]。Chen等[26]基于胴長與耳石輪紋半徑的線性關系在東北太平洋和西北太平洋柔魚群體間的差異，推測兩部分大型雌性群體(胴長>350 mm)可能來自于同一群體，這與利用STRUCTURE 2.3軟件推斷的北太平洋柔魚存在1個理論群相一致。

柔魚資源量豐富，已有研究認為傳統作業漁場最大可持續產量為8×104—10×104t[7]，而原流刺網作業海域柔魚資源量則超過30×104t[8]。但作為短生命周期種類，柔魚種群資源量的大小很容易受到環境變化的影響而發生波動[27]。2009年8—10月旺汛期間由于水溫變動，傳統作業漁場柔魚產量出現大幅度下降，其日產量僅為正常年份的一半[28]。2010—2012年本課題組對原流刺網作業海域柔魚資源量進行探捕調查，取得了較高的產量。因此，在對北太平洋柔魚資源進行評估與管理時，為了更加合理地開發、利用與保護該漁業資源，建議將不同的產卵季節—地理群體看作1個管理單元。

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