天然蝦青素對大鼠MCAO模型的保護作用研究

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1.昆明醫科大學第四附屬醫院康復醫學科，云南 昆明 650021；2. 云南中醫學院，云南 昆明 650500

天然蝦青素對大鼠MCAO模型的保護作用研究

潘雷1周瑩1劉路明1萬慶家2孫承鋒1尹勇1遲越2*

1.昆明醫科大學第四附屬醫院康復醫學科，云南 昆明 650021；2. 云南中醫學院，云南 昆明 650500

目的: 探討天然蝦青素對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用及機制。方法: 采用線栓法復制大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷(MCAO)模型，以神經學評分、腦梗塞體積、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)為評價指標，考察天然蝦青素的腦保護作用。結果: 天然蝦青素能夠明顯改善模型動物的神經病學癥狀，縮小腦梗塞體積，升高血清SOD活性，降低血清MDA水平。結論: 天然蝦青素在防治大鼠腦缺血/再灌注損傷方面具有明顯作用，其作用與抗氧化損傷有關。

蝦青素；腦缺血/再灌注；抗氧化

天然蝦青素(astaxanthin)是廣泛存在于人類日常食物中的一種具有極強抗氧化活性的類胡蘿卜素，雖然其結構類似于β-胡蘿卜素(β-carotene)和葉黃素(lutein),但純品蝦青素的抗氧化活性卻是兩者的5～15倍[1]。大量研究表明，天然來源的抗氧化劑如維生素E[2]、銀杏提取物[3]、番茄紅素[4]等對哺乳類動物中風模型具有顯著的腦保護作用，臨床研究顯示[5]，男性吸煙者經常食用富含抗氧化活性的食物可降低腦梗塞的風險，結合這些報道提示，具有抗氧化活性的成分或許能夠減輕缺血所導致的腦神經損傷。為探討天然來源的蝦青素是否也具有對抗腦缺血/再灌注損傷的作用，故進行本文的研究，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 蝦青素，云南白鷗制藥有限公司提供，批號：20140321，純度90%；依達拉奉購自Adamas Reagent Co.,Ltd.； 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司；SOD試劑盒和MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；水合氯醛:分析純，購自天津市科密歐化學試劑開發中心。

1.1.2 實驗動物 清潔級SD大鼠，雄性，體重250～300g，由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，動物合格證號：SCXK(川)2008-24。

1.1.3 主要儀器 酶標儀(infinite M200 PRO)；臺式低速離心機(上海電機廠)

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 SD大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、陽性對照組(依達拉奉：10mg/kg，ip.)、蝦青素高劑量藥組(10mg/kg，花生油配制，ig.)和蝦青素低劑量藥組(5mg/kg，花生油配制，ig.)，每組8只。假手術組分離大鼠左側頸總動脈及頸內外動脈，但不插魚線，灌胃給予花生油；模型組，復制MCAO模型，灌胃給予給予花生油；陽性對照組、蝦青素高、低劑量藥組，預防性連續給藥7d，末次給藥1h復制MCAO模型，每組動物手術缺血2h，再灌注24h，進行各指標的檢測。

1.2.2 大鼠MCAO模型復制 參照Longa[6]等報道的方法，稍加改進，采用線栓法復制短暫性大鼠腦中動脈閉塞(MCAO)模型。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 神經學評分 復制MCAO模型后，采用改良的Bederson法[7](見表1)進行神經功能缺損評分。

表1 改良Bederson法評分標準

1.2.3.2 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)染色及腦梗死體積的測定 缺血2h再灌注24h時，各組大鼠用10% 水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后，腹主動脈取血，常規方法分離血清備用，斷頭取腦，沿腦橋上界面切斷，去除嗅球，稱全腦重，立即放入-20℃冰箱，20min 后取出。由前向后做連續冠狀切片，共5片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點；第二刀在視交叉處；第三刀在漏斗柄處；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。將腦切片置入0.1% TTC溶液中，后放入恒溫振蕩器中，37℃避光染色30min。將腦切片取出后放入4% 中性多聚甲醛中固定24h，取出腦片，用數碼相機拍照，用Motic Images Plus 2.0 顯微圖象分析系統計算梗塞面積(粉紅色為未受損的正常組織，而梗塞區則因線粒體損害不染色，呈白色)，由于水腫對其梗塞體積有影響，故采用公式對其修正。具體公式如下：

腦梗塞灶體積(mm3)=總梗塞面積×腦片厚度(2mm)

水腫修正后的腦梗塞灶體積(mm3)=梗塞體積×對側半球體積/同側半球體積

梗塞率(%)=水腫修正后的腦梗塞灶體積/雙側大腦半球體積×100%

1.2.3.3 血清SOD和MDA含量測定 嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計方法 計量資料采用單因素方差分析法處理數據，方差齊者采用LSD法檢驗，方差不齊者采用Tamhane′s法檢驗。

2 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 天然蝦青素對大鼠MCAO模型神經病學癥狀的影響 結果顯示，天然蝦青素高、低劑量均能改善大鼠MCAO模型的神經病學癥狀，詳見表2。

表2 天然蝦青素對大鼠MCAO模型神經病學癥狀的影響(n=8)

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05。

2.1.2 天然蝦青素對大鼠MCAO模型腦梗塞體積的影響 結果顯示，天然蝦青素高、低劑量能顯著減少大鼠MCAO模型腦梗塞體積。詳見表3、圖1。

表3 天然蝦青素對大鼠MCAO模型腦梗塞體積的影響(n=8)

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較,**P<0.01，*P<0.05。

注：a：假手術組， b：模型組，c：依達拉奉，d：蝦青素高劑量，e：蝦青素低劑量

圖1各組對大鼠腦缺血/再灌注損傷的預防作用

2.1.3 天然蝦青素對大鼠MCAO模型血清SOD和MDA含量的影響 結果顯示，天然蝦青素可提高大鼠MCAO模型血清SOD含量，降低MDA含量，詳見表4。

表4 天然蝦青素對大鼠MCAO模型血清SOD和MDA含量的影響(n=8)

注：與假手術組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.2 討論

根據國家衛生部公布的第三次全國慢性非傳染性疾病死因調查結果顯示，腦血管疾病已占死亡總數的22.45%，目前中國每年腦卒中新發病例有250萬，而死于腦卒中的約有150萬人，腦血管疾病已成為嚴重危害人類健康的疾病之一。在腦血管疾病中，缺血性腦血管病是其主要的組成部分，目前臨床治療缺血性人腦血管病主要采用溶栓藥物，但該治療方案時間窗較窄，若超過時間窗應用溶栓藥物可帶來再灌注損傷的風險，因此尋找更加安全有效的抗腦缺血損傷藥物是當前腦血管疾病研究的重點之一。有證據表明，氧自由基增加是腦缺血/再灌注損傷的一個重要因素，自由基的鏈鎖反應是腦組織缺血/再灌注損傷的核心病理環節，腦是含磷脂極豐富的器官，在自由基脂質過氧化反應中可產生大量脂質過氧化產物丙二醛(MDA)，間接反應了體內氧自由基的代謝情況，而超氧化物歧化酶(SOD)可催化1分子O2氧化生成O2，另一分子O2還原生成H2O2，后者通過過氧化酶作用還原成水，從而減少腦組織中氧自由基的含量，對抗脂質過氧化反應對組織的破壞，因此，具有抗氧化損傷活性的成分可能具有潛在的腦保護作用。本實驗的研究表明，天然蝦青素對大鼠MCAO模型的腦損傷具有顯著的保護作用，可以縮小腦梗塞體積，改善神經病學評分，并且可明顯提高模型動物血清中SOD活性,減少血清中MDA的含量，提示，天然蝦青素的抗氧化作用可能是其抗腦缺血/再灌注損傷的機制之一。

[1] Naguib Y M.Antioxidant activities of astaxanthin and related carotenoids[J].J Agric Food Chem,2000,8:1150-1154.

[2] Khanna S, Roy S,Slivka A,et al.Neuroprotective properties of the natural vitamin E alpha-tocotrienol[J].Stroke,2005,36:2258-2264.

[3] Zhang W R, Hayashi T, Kitagawa H, et al. Protective effect of ginkgo extract on rat brain with transient middle cerebral artery occlusion[J].Neurol Res,2000,22:517-521.

[4] Hsiao G,Fong T H,Tzu N H,et al.A potent antioxidant, lycopene,affords neuroprotection against microglia activation and focal cerebral ischemia in rats[J].In Vivo,2004,18:351-356.

[5] Hirvonen T, Virtamo J, Korhonen P, et al. Intake of flavonoids, carotenoids, vitamins C and E, and risk of stroke in male smokers[J].Stroke.2000,31,2301-2306.

[6] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al .Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[7] Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M ,et al .Rat middle cerebral artery occlusion: Evalution of the model and development of a neur-ological examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[8] 趙丹洋，趙明奇，吳偉康，等.中藥HDO2抗腦缺血/再灌注損傷的作用及機制研究[J].中藥材，2005，28(12)：1083-1085

Protectiveeffectofnaturalastaxanthinonratcerebralischemia/reperfusioninjury

PAN Lei1,ZHOU Ying1,LIU Lu-ming1,WAN Qing-jia2,SUN Cheng-feng1,YIN Yong1,CHI Yue2*

1.Department of Physical Medicine and Rehabilitation,the Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650021，China; 2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China

ObjectiveTo observe the effect of the natural astaxanthin on the rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury and detect the mechanism of it.MethodsThe middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was used. The neurological score, infarct volume, the content of SOD and MDA in the serum were evaluated.ResultsThe results showed that the natural astaxanthin could significantly improve the neurological symptoms, reduce the infarct volume, increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in serum.ConclusionThe natural astaxanthin had a significant protective effect on rat cerebral ischemia/reperfusion injury. The mechanism may be related to antioxidant.

Astaxanthin;Cerebral ischemia/reperfusion injury;Antioxidant activity

云南省科技計劃項目(2010CD186)；云南省教育廳科學研究基金項目(2010C083)。

遲越,E-mail:1735871@qq.com

R965.1

A

1007-8517(2014)23-0009-03

2014.10.20)