PCR反向膜雜交法在CT、UU、NG三種性病篩查中的應用價值

王濤 王鵬 董麗

沙眼衣原體（CT）、解脲脲原體（Uu）及淋球菌（NG）是性病的主要病原體。近年研究表明，采用常規PCR擴增產物，再采用膜雜交技術鑒定擴增產物，可保持雜交特異性，診斷正確率高[1-3]。本研究對1486例疑為泌尿生殖道感染的患者采用PCR反向膜雜交法篩查，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 1486例為2013年1月-2014年6月到本院治療的疑似泌尿生殖道感染患者，大部分患者存在外陰搔癢、不適等癥狀，已將1個月內使用過抗支原體、衣原體藥物者剔除。其中男634例，女852例；年齡17~60歲，平均（33.6±5.7）歲。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器與試劑 人乳頭狀瘤病毒分型檢測試劑盒（深圳生化有限責任公司生產）；MJopticon2型FQPCR擴增分析儀及其配套試劑（美國生產）；CT快速檢測卡，UU、NG培養基（潮州凱普生物化學有限公司生產）。

1.2.2 標本采集 男性標本：將消毒棉拭子伸入受檢者尿道口中1~2 cm，旋轉10 s取分泌物。女性標本：將消毒棉拭子插入宮頸1~2 cm處，旋轉20 s取上皮細胞。男、女各取3份分泌物標本。

將其中兩份置入1 mL無菌生理鹽水試管中，加入2 mL漂洗液放入離心機中進行12 000 r/min離心處理15 min，隨后在離心沉淀中滴入50 μL DNA提取液，搖勻后放入100 ℃沸水中浸浴15 min；隨后再進行15 000 r/min離心處理10 min，取5 μL上清液進行擴增處理[4]。

另1份標本置入培養基中培養，CT采用Hela-229及McCoy細胞培養，培養24 h；將UU培養基放入37 ℃左右的溫箱中培養，48 h后觀察標本顏色；NG接種于巧克力平板，置于37 ℃溫箱培養，加入5%CO2，培養 24 h[5]。

1.2.3 PCR擴增反應 取處理好的上清液進行PCR擴增反應，均嚴格按照說明書要求操作。每次檢測均設陰性、陽性及空白對照。

1.2.4 膜雜交反應 （1）DNA變性：將20 μL DNA變形液加入擴增后的上清液中，搖勻放置2 min充分反應。（2）雜交：在酶板條第一排孔中加入40 mL雜交緩沖溶液A，按順序滴入10 μL變性DNA液，搖勻后插入對應雜交膜，于37 ℃恒溫箱中放置5~10 min。（3）洗膜：在酶板條第二排孔中滴入1滴雜交緩沖液B，將之前制成的雜交梳按序號置入，放入37 ℃恒溫箱中7~10 min。（4）酶結合：在酶板條第三排孔中滴入1滴SA-AP，按順序將前面第二排雜交梳插入對應孔中，放入25 ℃恒溫箱中7~10 min。（5）顯色：在酶板條第四排孔中分別滴入1滴顯色物液 A和顯色物底物液B，混勻后將之前第三排雜交梳插入對應孔中，放入25 ℃恒溫箱中5~10 min[6]。

1.2.5 FQ-PCR擴增反應 取1份離心處理后的上清液，按照試劑盒的操作要求置入反應管中，上機進行FQ-PCR擴增反應。反應條件為：93 ℃ 2 min預變性；93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，10 個循環；93 ℃ 30 s，55 ℃45 s，30個循環[7]。每次檢測均設陰性、陽性及空白對照，以試劑盒中給出的DNA濃度作標準曲線，以此標準定量法測定。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件包對數據行統計學分析，計數資料采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測結果 1486例患者中，培養法檢測出947例（63.73%）陽性，539例（36.27%）CT、UU、NG全陰性。FQ-PCR陽性率為70.25%，與培養法比較差異有統計學意義（ 字2=14.31，P<0.01）；PCR反向膜雜交法陽性率為66.96%，與培養法比較差異無統計學意義（字2=3.42，P>0.05）。FQ-PCR、PCR反向膜雜交法陽性率比較差異無統計學意義（字2=3.75，P>0.05）。見表1。

2.2 檢測敏感性及特異性 以培養法檢測結果作為金標準，FQ-PCR、PCR反向膜雜交法檢測的敏感性均為100%；FQ-PCR檢測的特異性為82.00%，PCR反向膜雜交法為91.09%，兩組比較差異有統計學意義（字2=19.13，P<0.01）。見表 2。

表1 FQ-PCR、PCR反向膜雜交法檢測CT、UU、NG陽性率比較 例（%）

表2 FQ-PCR、PCR反向膜雜交法檢測敏感性及特異性 例（%）

3 討論

CT、UU及NG是性傳播疾病的主要病原體。然而，這3種病原體感染癥狀不典型，部分患者甚至無任何癥狀，這給病原學診斷帶來挑戰。本文嘗試采用PCR反向膜雜交法篩查CT、UU及NG三種性病[8]。

培養法是性病病原體檢測的常規方法，但其培養時間較長，一般需要2~3 d才能獲得檢測結果，同時其對檢測設備及操作要求較高[9-10]。FQ-PCR法以其簡便、微量、快速等優勢而成為CT、UU、NG三種性病篩查的首選方法。FQ-PCR其是在原有PCR技術的基礎上，將熒光能量傳遞技術融合進來，通過電腦控制檢測實現了對擴增病原體的實時動態觀察，可較準確地反映病原體感染情況[11]。然而，FQ-PCR探針無法保持雜交特異性，在檢測中易產生非特異性及假陽性產物，使假陽性偏高。

隨著分子生物技術的發展，膜雜交技術逐漸應用于性病篩查中。PCR反向膜雜交技術應用DNA探針、核酸雜交，酶聯顯色等多種技術進行CT、UU、NG三種性病病原學檢測[12]。其利用PCR技術擴增產物，隨后采用核酸雜交、酶聯顯色對擴增產物進行鑒定，檢測準確性高[13]。本組中，PCR反向膜雜交法檢測陽性率略低于FQ-PCR，但兩組差異比較無統計學意義。由此可知，PCR反向膜雜交法檢與FQ-PCR有著同樣準確檢測優勢。PCR反向膜雜交法中的擴增產物用生物素標記后，其固定在膜條上的特異性探針進行反向膜雜交，探針捕獲的生物素標記和流動相中的靶序列特異性結合，酶催化底物顯色，并在膜上顯出藍色斑點[14]。膜雜交技術需要在固相載體膜上交聯特異性探針能夠很好的保持雜交的特異性，同時在試劑盒中加入duTP和UDCT酶等可消除擴增產物被污染對結果的干擾，可克服FQ-PCR的缺點[15]。本組中，PCR反向膜雜交法與FQ-PCR檢測的敏感性均為100%，證實兩種方法均可作為CT、UU、NG三種性病篩查的敏感性方法。但PCR反向膜雜交法檢測特異性顯著高于FQ-PCR（P<0.01）。由此可知，PCR反向膜雜交法可避免FQ-PCR檢測所具有的假陽性偏高的缺點。

綜上所述，PCR反向膜雜交法篩查CT、UU、NG準確，快速，且篩查特異性高于FQ-PCR，值得臨床推廣適用。

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