腫瘤壞死因子α及其基因238G>A和863C>A多態性與廣西壯族原發性高血壓的相關性研究

趙艷英　黃照河　潘興壽　李天資　梁燁

【摘要】目的探討腫瘤壞死因子α（TNFα）基因238G>A和863C>A多態性與廣西壯族原發性高血壓（EH）的相關性。方法采用ELISA法檢測152例廣西壯族EH患者（EH組）和50例廣西壯族健康者（對照組）血清TNFα、血脂、血糖（FBG）水平，用PCRSBT（PCR Sequencing Based Typing）方法檢測TNFα基因238G>A和863C>A多態性，探討血壓、血脂、FBG、TNFα水平與TNFα基因238G>A和863C>A的關聯性。結果EH組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FBG、TNFα、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、體重指數（BMI）與對照組比較差異有統計學意義（P<005或0.01 ）；與對照組比較，EH組TNFα863C>A GG基因型和等位基因頻率更高（P<0.05或0.01），TNFα238G>A AA基因型和等位基因頻率差異無統計學意義（P>005）。結論 廣西壯族原發性高血壓患者血清TNFα水平增高可能與TNFα238G>A有關聯，與863C>A基因多態性無明確關聯。

【關鍵詞】原發性高血壓； 腫瘤壞死因子α；基因多態性

中圖分類號：R544.1文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是導致腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病等重要疾病的主要危險因素之一[1]，近年來的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趨勢[2]。中國疾病預防控制中心（CDC）的橫斷面研究表明[3]，2010年我國成年人高血壓患病率為33.5%，估計患病人數為3.3億，每年有45萬人死于高血壓。EH的發病機制還在探索之中，目前認為遺傳和環境因素的交互作用與EH的發生、發展及轉歸密切相關[4]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）基因啟動區基因多態性與TNFα的轉錄和分泌相關[5～9]，為了解TNFα基因多態性與EH的關聯性，本文探討TNFα238G>A及TNFα863C>A多態性與廣西壯族EH的相關性。1對象與方法1.1研究對象EH組選擇雙親均為壯族的原發性高血壓患者152例（樣本來源于廣西百色地區）作為觀察對象，均簽署知情同意書，其中男93例，女59例，平均年齡為（55.9±13.7）歲。中國高血壓防治指南（2010年修訂本）診斷標準，EH為：收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血壓史，正在服用降壓藥者，雖血壓<140/90 mmHg，也可入選。排除繼發性高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、腦梗死、心力衰竭、泌尿系統疾病、感染性疾病、腫瘤、嚴重的肝腎功能不全及應用抗炎藥物、免疫抑制劑，不能耐受檢查者。對照組為正常血壓受試者50人，男30人，女20人，平均年齡為（52.9±12.7）歲，常規檢查均無高血壓、糖尿病、高血脂、腎病等。入選者雙親均為壯族，對象之間無血緣關系，年齡、性別構成與EH組比較差異無統計學意義（P>005）。

1.2研究方法

1.2.1血壓的測量方法受檢者均于早晨6：00～7：00進行，取臥位，采用校正水銀血壓計，以Korotkoff法測量右上臂SBP、DBP，每次間隔5 min，連續測量3次，取平均值為血壓值，并測量身高和體重。

1.2.2生化指標的檢測受檢者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取靜脈血約7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天內提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后離心3000 r/min 20 min分裝血清，一部分直接送檢空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指標，一部分置于-80℃冰箱中以備檢測TNFα血清水平。

1.2.3血清TNFα的測定采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA），操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。使用美國BIORAD680酶標儀450 nm波長下測量各孔OD值，用專業軟件Curve Expert 1.3繪制標準曲線，r=0.99987，根據樣本OD值計算出相應的濃度，即為對應樣本的血清濃度。

1.2.4基因組DNA的制備采用離心柱型提取血液基因組DNA，操作方法嚴格按照人血液基因組DNA提取試劑盒說明書進行，試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。經超微量分光光度計NanoVue檢測OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分裝后放置-80℃冰箱備用。

1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多態性檢測PCR擴增： PCR擴增儀為BioRadPTC200，PCR試劑Premix Ex TaqTMVersion 2.0購自日本TAKARA。引物（Primer）由寶生物工程（大連）有限公司設計及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，FP）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR總反應體系為50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（濃度0.5～1.0 μg），滅菌蒸餾水20 μl，上下游引物各1 μl，樣品混合后置PCR儀30個循環。TNFα238G>A反應條件：98℃變性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反應條件：98 ℃變性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A擴增片段長度為321 bp，TNFα863C>A擴增片段長度為302 bp。反應完成后取PCR產物5 μl用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠垂直電泳觀察PCR產物情況，電壓90 mV時間30 min，電泳液為0.5×TBE液，若相應位置有清晰擴增單一條帶，則純化后行測序反應。

1.2.6PCR產物純化及測序使用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物條帶和濃度，對PCR產物濃度進行過膜純化或者切膠純化以及定量，采用sanger法進行測序，測序分析儀為3730XL測序分析儀，測序膠是POP7，均購自美國AB公司。測定結果出現雙峰， 則該位點為雜合子型， 出現單峰為純合子型。使用chromatogram file 軟件分析測序結果，采用直接基因計數法對基因型及等位基因頻率進行統計。

【摘要】目的探討腫瘤壞死因子α（TNFα）基因238G>A和863C>A多態性與廣西壯族原發性高血壓（EH）的相關性。方法采用ELISA法檢測152例廣西壯族EH患者（EH組）和50例廣西壯族健康者（對照組）血清TNFα、血脂、血糖（FBG）水平，用PCRSBT（PCR Sequencing Based Typing）方法檢測TNFα基因238G>A和863C>A多態性，探討血壓、血脂、FBG、TNFα水平與TNFα基因238G>A和863C>A的關聯性。結果EH組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FBG、TNFα、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、體重指數（BMI）與對照組比較差異有統計學意義（P<005或0.01 ）；與對照組比較，EH組TNFα863C>A GG基因型和等位基因頻率更高（P<0.05或0.01），TNFα238G>A AA基因型和等位基因頻率差異無統計學意義（P>005）。結論 廣西壯族原發性高血壓患者血清TNFα水平增高可能與TNFα238G>A有關聯，與863C>A基因多態性無明確關聯。

【關鍵詞】原發性高血壓； 腫瘤壞死因子α；基因多態性

中圖分類號：R544.1文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是導致腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病等重要疾病的主要危險因素之一[1]，近年來的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趨勢[2]。中國疾病預防控制中心（CDC）的橫斷面研究表明[3]，2010年我國成年人高血壓患病率為33.5%，估計患病人數為3.3億，每年有45萬人死于高血壓。EH的發病機制還在探索之中，目前認為遺傳和環境因素的交互作用與EH的發生、發展及轉歸密切相關[4]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）基因啟動區基因多態性與TNFα的轉錄和分泌相關[5～9]，為了解TNFα基因多態性與EH的關聯性，本文探討TNFα238G>A及TNFα863C>A多態性與廣西壯族EH的相關性。1對象與方法1.1研究對象EH組選擇雙親均為壯族的原發性高血壓患者152例（樣本來源于廣西百色地區）作為觀察對象，均簽署知情同意書，其中男93例，女59例，平均年齡為（55.9±13.7）歲。中國高血壓防治指南（2010年修訂本）診斷標準，EH為：收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血壓史，正在服用降壓藥者，雖血壓<140/90 mmHg，也可入選。排除繼發性高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、腦梗死、心力衰竭、泌尿系統疾病、感染性疾病、腫瘤、嚴重的肝腎功能不全及應用抗炎藥物、免疫抑制劑，不能耐受檢查者。對照組為正常血壓受試者50人，男30人，女20人，平均年齡為（52.9±12.7）歲，常規檢查均無高血壓、糖尿病、高血脂、腎病等。入選者雙親均為壯族，對象之間無血緣關系，年齡、性別構成與EH組比較差異無統計學意義（P>005）。

1.2研究方法

1.2.1血壓的測量方法受檢者均于早晨6：00～7：00進行，取臥位，采用校正水銀血壓計，以Korotkoff法測量右上臂SBP、DBP，每次間隔5 min，連續測量3次，取平均值為血壓值，并測量身高和體重。

1.2.2生化指標的檢測受檢者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取靜脈血約7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天內提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后離心3000 r/min 20 min分裝血清，一部分直接送檢空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指標，一部分置于-80℃冰箱中以備檢測TNFα血清水平。

1.2.3血清TNFα的測定采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA），操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。使用美國BIORAD680酶標儀450 nm波長下測量各孔OD值，用專業軟件Curve Expert 1.3繪制標準曲線，r=0.99987，根據樣本OD值計算出相應的濃度，即為對應樣本的血清濃度。

1.2.4基因組DNA的制備采用離心柱型提取血液基因組DNA，操作方法嚴格按照人血液基因組DNA提取試劑盒說明書進行，試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。經超微量分光光度計NanoVue檢測OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分裝后放置-80℃冰箱備用。

1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多態性檢測PCR擴增： PCR擴增儀為BioRadPTC200，PCR試劑Premix Ex TaqTMVersion 2.0購自日本TAKARA。引物（Primer）由寶生物工程（大連）有限公司設計及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，FP）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR總反應體系為50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（濃度0.5～1.0 μg），滅菌蒸餾水20 μl，上下游引物各1 μl，樣品混合后置PCR儀30個循環。TNFα238G>A反應條件：98℃變性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反應條件：98 ℃變性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A擴增片段長度為321 bp，TNFα863C>A擴增片段長度為302 bp。反應完成后取PCR產物5 μl用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠垂直電泳觀察PCR產物情況，電壓90 mV時間30 min，電泳液為0.5×TBE液，若相應位置有清晰擴增單一條帶，則純化后行測序反應。

1.2.6PCR產物純化及測序使用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物條帶和濃度，對PCR產物濃度進行過膜純化或者切膠純化以及定量，采用sanger法進行測序，測序分析儀為3730XL測序分析儀，測序膠是POP7，均購自美國AB公司。測定結果出現雙峰， 則該位點為雜合子型， 出現單峰為純合子型。使用chromatogram file 軟件分析測序結果，采用直接基因計數法對基因型及等位基因頻率進行統計。

【摘要】目的探討腫瘤壞死因子α（TNFα）基因238G>A和863C>A多態性與廣西壯族原發性高血壓（EH）的相關性。方法采用ELISA法檢測152例廣西壯族EH患者（EH組）和50例廣西壯族健康者（對照組）血清TNFα、血脂、血糖（FBG）水平，用PCRSBT（PCR Sequencing Based Typing）方法檢測TNFα基因238G>A和863C>A多態性，探討血壓、血脂、FBG、TNFα水平與TNFα基因238G>A和863C>A的關聯性。結果EH組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FBG、TNFα、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、體重指數（BMI）與對照組比較差異有統計學意義（P<005或0.01 ）；與對照組比較，EH組TNFα863C>A GG基因型和等位基因頻率更高（P<0.05或0.01），TNFα238G>A AA基因型和等位基因頻率差異無統計學意義（P>005）。結論 廣西壯族原發性高血壓患者血清TNFα水平增高可能與TNFα238G>A有關聯，與863C>A基因多態性無明確關聯。

【關鍵詞】原發性高血壓； 腫瘤壞死因子α；基因多態性

中圖分類號：R544.1文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是導致腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病等重要疾病的主要危險因素之一[1]，近年來的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趨勢[2]。中國疾病預防控制中心（CDC）的橫斷面研究表明[3]，2010年我國成年人高血壓患病率為33.5%，估計患病人數為3.3億，每年有45萬人死于高血壓。EH的發病機制還在探索之中，目前認為遺傳和環境因素的交互作用與EH的發生、發展及轉歸密切相關[4]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）基因啟動區基因多態性與TNFα的轉錄和分泌相關[5～9]，為了解TNFα基因多態性與EH的關聯性，本文探討TNFα238G>A及TNFα863C>A多態性與廣西壯族EH的相關性。1對象與方法1.1研究對象EH組選擇雙親均為壯族的原發性高血壓患者152例（樣本來源于廣西百色地區）作為觀察對象，均簽署知情同意書，其中男93例，女59例，平均年齡為（55.9±13.7）歲。中國高血壓防治指南（2010年修訂本）診斷標準，EH為：收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血壓史，正在服用降壓藥者，雖血壓<140/90 mmHg，也可入選。排除繼發性高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、腦梗死、心力衰竭、泌尿系統疾病、感染性疾病、腫瘤、嚴重的肝腎功能不全及應用抗炎藥物、免疫抑制劑，不能耐受檢查者。對照組為正常血壓受試者50人，男30人，女20人，平均年齡為（52.9±12.7）歲，常規檢查均無高血壓、糖尿病、高血脂、腎病等。入選者雙親均為壯族，對象之間無血緣關系，年齡、性別構成與EH組比較差異無統計學意義（P>005）。

1.2研究方法

1.2.1血壓的測量方法受檢者均于早晨6：00～7：00進行，取臥位，采用校正水銀血壓計，以Korotkoff法測量右上臂SBP、DBP，每次間隔5 min，連續測量3次，取平均值為血壓值，并測量身高和體重。

1.2.2生化指標的檢測受檢者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取靜脈血約7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天內提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后離心3000 r/min 20 min分裝血清，一部分直接送檢空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指標，一部分置于-80℃冰箱中以備檢測TNFα血清水平。

1.2.3血清TNFα的測定采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA），操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。使用美國BIORAD680酶標儀450 nm波長下測量各孔OD值，用專業軟件Curve Expert 1.3繪制標準曲線，r=0.99987，根據樣本OD值計算出相應的濃度，即為對應樣本的血清濃度。

1.2.4基因組DNA的制備采用離心柱型提取血液基因組DNA，操作方法嚴格按照人血液基因組DNA提取試劑盒說明書進行，試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。經超微量分光光度計NanoVue檢測OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分裝后放置-80℃冰箱備用。

1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多態性檢測PCR擴增： PCR擴增儀為BioRadPTC200，PCR試劑Premix Ex TaqTMVersion 2.0購自日本TAKARA。引物（Primer）由寶生物工程（大連）有限公司設計及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，FP）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR總反應體系為50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（濃度0.5～1.0 μg），滅菌蒸餾水20 μl，上下游引物各1 μl，樣品混合后置PCR儀30個循環。TNFα238G>A反應條件：98℃變性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反應條件：98 ℃變性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A擴增片段長度為321 bp，TNFα863C>A擴增片段長度為302 bp。反應完成后取PCR產物5 μl用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠垂直電泳觀察PCR產物情況，電壓90 mV時間30 min，電泳液為0.5×TBE液，若相應位置有清晰擴增單一條帶，則純化后行測序反應。

1.2.6PCR產物純化及測序使用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物條帶和濃度，對PCR產物濃度進行過膜純化或者切膠純化以及定量，采用sanger法進行測序，測序分析儀為3730XL測序分析儀，測序膠是POP7，均購自美國AB公司。測定結果出現雙峰， 則該位點為雜合子型， 出現單峰為純合子型。使用chromatogram file 軟件分析測序結果，采用直接基因計數法對基因型及等位基因頻率進行統計。