誘導食用真菌代謝生產木聚糖酶的研究

邢振楠，臧海蓮，王丹麗，范冬茹

(1.伊春林業科學院，黑龍江伊春153000；2.東北農業大學)

木聚糖酶(xylanase)是一類能夠破壞植物纖維組織，降解半纖維素，主要成分為木聚糖的一組酶的總稱，屬于水解酶、胞外酶類，具有可誘導性。木聚糖酶已被廣泛應用于工業生產，動物飼喂，食品加工，能源開發，環境治理，造紙業以及功能性低聚糖制備等領域[1-4]，同時，還可為食用菌品種選育及分類提供重要參考[5]。木聚糖酶產生菌主要來源于自然菌株篩選，或通過誘變、基因工程、蛋白質工程等分子技術改造產酶基因改變及提高菌體木聚糖酶分泌量。目前國內外的研究主要集中在利用工程化菌株生產木聚糖酶，研究最多的是青霉、木霉、黑曲霉、鏈霉菌、酵母菌[6-9]等。利用大型食用真菌液體發酵生產木聚糖酶鮮有報道。本研究以不同種木聚糖結構類似物誘導液體發酵培養食用菌菌絲，從66株不同種的大型食用真菌中篩選產木聚糖酶能力較強的菌株，進行誘導條件優化以確定最佳產木聚糖酶條件，同時，對液體發酵食用菌菌絲的多糖含量進行測定，為木聚糖酶生產及食用菌菌絲深加工提供基礎數據和研究資料。

1 材料與方法

1.1 菌種及藥品

66個種(11株靈芝、9株木耳，18株香菇，及28株其他大型真菌)的食用真菌菌絲體為實驗對象，菌種來自全國不同地域的多家科研機構，部分野生品種采自黑龍江省伊春市小興安嶺地區。本實驗藥品均為分析純化學品。

1.2 培養基及培養方式

誘導培養基Ⅰ(g/L)：木聚糖類似物，蛋白胨2.0 g, 酵母膏2.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g , K2HPO41.0 g , KH2PO40.46 g。

誘導培養基Ⅱ(g/L)：馬鈴薯200.0 g煮沸30min浸出液，木聚糖類似物。

其中木聚糖類似物：可溶性淀粉、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、木聚糖、葡萄糖、木糖、微晶纖維素，添加濃度按實驗組別要求。

3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑：將6.3 g DNS和262.0 mL 2M NaOH溶液，加到500.0 mL含有185.0 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5.0 g結晶酚和5.0 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。

檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液(pH5)：0.2 mol/L Na2HPO410.3 mL，0.1 mol/L檸檬酸 9.7 mL。

1.3 菌株培養及木聚糖酶活力測定

1.3.1 食用真菌菌絲產木聚糖酶誘導培養

2種不同誘導培養基與7種誘導底物的不同濃度交叉組合，150 r/min、25℃恒溫液體搖瓶培養，培養時間與培養基pH值根據實驗組要求設定，測算66種大型食用真菌菌絲誘導培養后產木聚糖酶的酶活，比較產酶能力。

1.3.2 木聚糖酶活力定義

1 mL酶液在溫度為50℃，pH值5.0條件下，1min水解木聚糖生成1μmol木糖還原物質的量為1個酶活力單位，以IU/mL表示。

1.3.3 超薄層瓊脂板擴散法快速檢測法[10-11]

配制含0.1%木聚糖-檸檬酸磷酸二氫鈉瓊脂膠板，待膠板冷凝后在其上打出若干個直徑為0.7 cm的孔穴，用微量注射器向孔穴內適量加入粗酶液，3重復。加入酶液的瓊脂薄板置50℃條件下，緩沖液保濕反應3 h。取出薄板，用0.1%剛果紅液染色30 min后，lM NaC1溶被中漂洗2次，每次5min，此時顯現透明圈，再放入5%乙酸中至底物變為紫色，游標卡尺測量透明圈直徑，比較木聚糖酶的活性大小。

1.3.4 DNS法[12-13]

取4支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，編號后各加入2 mL 1%木聚糖溶液，并向1號試管中加入5 mL DNS溶液以鈍化酶活性，將4支試管同時在50℃水浴中預熱10 min，再各加入酶液1 mL， 2號試管中加入等體積的蒸餾水替代酶液，50℃ 水浴中保溫3 h后取出，立即向2、3、4號試管中各加入5 mL DNS溶液以終止酶反應，充分搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。以1號試管溶液為空白對照調零點，在540 nm波長下測定2、3、4號試管液的OD值。

1.4 不同環境因素對誘導食用真菌提高木聚糖酶產量的影響

根據不同菌種利用誘導底物的能力添加木聚糖類似物研究不同底物濃度對真菌菌絲產木聚糖酶能力的影響，分別以0.1%、0.25%、0.5%、1%的梯度差添加誘導底物作為濃度試驗組，以不添加誘導底物培養基培養作對照；分別以pH值為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0作為酸堿度試驗組，以pH值7.0作對照；分別以15、20、25、30、35 d作為培養天數試驗組。以上各試驗組分別以誘導培養基Ⅰ、Ⅱ為培養液, 等量接種，按照1.3.1操作，設置對照組，按照1.3.3及1.3.4定時檢測實驗菌株產木聚糖酶能力。

1.5 誘導食用真菌產木聚糖酶條件優化

參考1.4單因素對食用真菌菌株產酶的影響結果，設計3因素3水平實驗，選用L9(33)正交表，擬定的正交試驗因素與水平見表1。

表1 實驗因素與水平表

1.6 食用真菌菌絲胞內多糖提取

將50℃烘至恒重的食用菌菌絲體加入30倍蒸餾水，800 W微波處理10 min，過濾沉淀，取上清，加入95%乙醇，至乙醇終濃度為75%～80%，-4℃醇沉過夜。4000 r/min離心10 min沉淀食用菌粗多糖，30∶1水稀釋沉淀，按照體積比3∶1加入sevag試劑(氯仿∶異戊醇=24∶1) ，渦旋震蕩充分混勻，4000 r/min離心15 min去除蛋白及雜質，重復以上步驟，至蛋白質完全去除，取上清，3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，4000 r/min離心15min后，沉淀物60℃烘干，所得即為食用菌多糖。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶高產食用真菌菌種篩選

經初篩和復篩后可最終確定黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236三株食用真菌菌絲體在不同培養條件以木聚糖為誘導物，采用誘導培養基Ⅰ液體發酵培養一定時間后產木聚糖酶和多糖的能力相對較強，針對這3株菌進行后續實驗。本實驗篩選確定的可誘導高產木聚糖酶的黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236均為伊春林科院保藏菌種。

2.2 單因素影響試驗結果

圖1 木聚糖酶作用木糖酶活標準曲線

由圖1可知，該實驗設計和檢測方法可行，酶活力可用OD540數值反應，檢測木聚糖酶最小濃度為0.0001 g/mL，即可檢測0.069 IU/mL活力的木聚糖酶。并且，實驗發現，底物濃度一定，酶濃度高于一定值時DNS檢測值不再變化。

A

B

C

由圖2可知，不同菌種產木聚糖酶的能力受環境因素影響較大。其中，以木聚糖為誘導底物，當每100mL培養基中加入0.75g木聚糖誘導不同菌種生產木聚糖酶均可獲得較好的酶活，即酶產量最高。由圖2B可知，培養液pH值對菌種產木聚糖酶影響較大，并且，不同菌種對培養液pH值要求不同，黑木耳LK8和玉田平菇在pH =7.0時，菌種產酶能力最強，黑木耳LK8對培養基的要求中性偏堿性(OD540=2.43)，而玉田平菇則要求偏酸性(OD540=2.40)，香菇236在pH =5.0時，菌種產酶能力最強(OD540=2.12)，酸性條件下誘導該菌種產木聚糖酶能力較強。通過由圖2C可知，經20～35d液體誘導培養3株菌均可產生較高活性的木聚糖酶，產酶能力較強，其中，黑木耳LK8誘導培養25d產酶效果最佳(OD540=2.0067)，誘導培養30d玉田平菇和香菇236的產酶能力較高(OD540分別為2.1091，1.9851)。

2.3 誘導培養條件優化結果

直觀分析結果見表2，由各因素均值分析可知：黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236誘導產木聚糖酶酶活最高的最佳條件組合分別為A1B3C3，A2B3C3，A2B2C2，即最佳培養時間、pH值和底物木聚糖濃度(g/100mL)分別為20 d、7.5和1.0g/100mL；25 d、7.0和1.0 g/100mL；25 d、5.0和0.75 g/100mL。最佳條件組合時的酶活分別為：600.6IU/mL，672.5 IU/mL，345 IU/mL。由極差數據分析可知，黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236誘導培養受各因素影響大小順序分別為：誘導培養液pH>底物濃度>誘導時間，誘導培養液pH >誘導時間>底物濃度，誘導培養液pH >誘導時間>底物濃度，可見，本實驗篩選出的3株經木聚糖誘導產木聚糖酶活性較高的食用真菌誘導過程中誘導培養液pH值是影響誘導效果的主要因素。

表2 正交試驗結果直觀分析表

2.4 食用菌多糖產量

圖3 菌絲多糖產量圖

15 d相同培養條件下，每100 mL黑木耳LK8、玉田平菇及香菇236液體培養菌絲體產精多糖量分別為0.0278 g， 0.0121 g，0.0025 g，菌絲多糖產率如圖3所示。

3 討論

木聚糖(xylan)是植物半纖維素的主要成份，是除纖維素之外自然界中最為豐富的多糖，也是自然界中最為豐富的可再生資源之一。水解酶系中各種酶相互之間協同完成，其中木聚糖酶是最關鍵的，然而，由于木聚糖復雜的化學結構和異質性，很大一部分木聚糖未得到有效利用，造成巨大的資源浪費。木聚糖酶是自然界中專性降解木聚糖的水解酶系，經過木聚糖酶的系內各種酶相互之間協同作用，木聚糖可完全被降解為小分子而參與自然生態循環。根據木聚糖酶的這一特性，生產木聚糖酶劑參與工業生產是可以低能耗高效率地利用木聚糖的最佳方式，因此，隨著應用領域的增多，如何提高產量、降低成本，獲得適應性強，應用范圍廣的木聚糖酶成為研究者們主要研究方向。

由微生物代謝生產的木聚糖酶根據理化性質的不同可分為酸性、中性、堿性木聚糖酶；根據作用底物的特異性，又可將木聚糖酶分為特異性和非特異性。本研究發現，誘導培養過程中食用菌菌絲體對培養基酸堿度要求差別很大，后續將就食用菌代謝生產的木聚糖的理化性質進行進一步研究，確定其理化性質及應用范圍，為木聚糖酶的使用應用積累數據。并且，實驗發現，菌絲生長前期產多糖比率較高，隨培養時間延長多糖比率有所下降，產酶能力則是隨菌絲代謝時間延長而增加，平衡產酶和產多糖時間點，是后續的主要研究內容。

食用菌做為主要的木腐性、草腐性真菌，通過分泌具有專性和高活性的纖維素酶和木聚糖酶系分解培養基質中的纖維素及半纖維素再加以吸收利用。另一方面，木聚糖酶屬胞外酶，具有可誘導性[14-16]，有研究表明，木聚糖及木聚糖類似物具有誘導木聚糖酶合成的功能[17-18]，可增加該酶代謝量，因此，開發研究利用食用菌代謝生產具有高活性的木聚糖酶是具有理論依據和可行性。并且，食用菌種類眾多，液體發酵技術成熟，食用菌多糖等附加值產值高，所以，探究大型食用真菌的深層價值，利用其生產木聚糖酶及其它酶系將成為未來科研的一個主要方向。

4 結論

4.1 以木聚糖為誘導底物，對66株大型食用真菌進行液體發酵誘導培養，篩選獲得3株產木聚糖酶較高的菌株，分別為黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236。

4.2 單因素結合正交試驗可確定黑木耳LK8、玉田平菇、香菇236誘導產木聚糖酶酶活最高的最佳條件組合培養時間、pH值和底物木聚糖濃度(g/100mL)分別為20d、7.5和1.0g/100mL；25 d、7.0和1.0 g/100mL；25 d、5.0和0.75 g/100mL。

4.3 最佳條件組合時的酶活分別為：600.6IU/ mL，672.5 IU/ mL，345 IU/ mL，培養液pH值是影響誘導效果的主要因素。

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