不同中藥對桑黃液體深層發(fā)酵的影響1）

程俊文，賀亮＊，胡傳久，魏海龍，付立忠，鄒景泉，韓素芳，韋朝陽

（1.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，杭州 310023；2.浙江大學生命科學學院，杭州 310058）

桑黃（Phellinusigniarius）俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等，是一種珍貴的大型藥用真菌。目前，桑黃是國際公認的生物抗癌領域中效果最好的真菌［1］。桑黃具有抗癌、抗炎、抗氧化、提高免疫力、保肝護肝等多種藥用功效［2-3］，現(xiàn)代藥理學研究表明，三萜、多糖和黃酮類物質是其關鍵藥性成分［4］。目前，桑黃在國際市場上供不應求，野生桑黃資源有限，桑黃的人工栽培研究在國內又剛剛起步，因此，采用液體發(fā)酵技術進行桑黃的規(guī)模化生產具有廣闊的前景。

中藥中含有豐富的纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等營養(yǎng)成分以及萜類、黃酮類、生物堿、皂甙類等活性物質［5］，有研究表明，在培養(yǎng)基中添加適量中藥成分，可促進藥用真菌的生長或提高活性產物的產量［6］，但中藥在桑黃液體發(fā)酵上的應用尚未見報道。本研究選用5味不同中藥添加到桑黃發(fā)酵培養(yǎng)基中，探究中藥對其菌體生長、代謝產物的合成的影響，為提高桑黃活性物質的液體發(fā)酵生產探索一條新的途徑。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

桑黃（Phellinusigniarius）：由浙江省林業(yè)科學研究院生物技術研究所實驗室保藏。

1.1.2 中藥材

薏苡仁、苦蕎、銀杏葉、連翹、金銀花購自杭州華東醫(yī)藥中藥材分公司，粉碎后備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PAD）：馬鈴薯浸出液200g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂15g／L，pH自然，在121℃下滅菌30min，備用。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g／L，酵母粉5g／L，KH2PO41.0g／L，MgSO40.5g／L，pH 自然，在121℃下滅菌30min，備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g／L，酵母粉3g／L，蛋白胨4g／L，KH2PO41.0g／L，MgSO40.5g／L，pH自然。

1.1.4 主要儀器

可見分光光度計（U-1900）；超凈工作臺（SWCJ-2F）；電子分析天平（BSA224S）；高壓滅菌鍋（SX500）；恒溫振蕩器（ZHWY-211B）；旋轉蒸發(fā)儀（R-210）；多功能高速離心機（CL31R）；真空干燥箱（DZF6020）；冷凍干燥機（LGJ-10C）等。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取液的制備

稱取適量中藥材（已粉碎，過60目），加6倍水浸泡0.5h，用電爐煎熬，調整適當?shù)募訜釡囟龋３譁睾偷姆序v狀態(tài)，煮沸30min，過濾收集提取液。重復提取1次，合并2次藥汁，用8層紗布過濾，所得藥汁用于桑黃液體搖瓶培養(yǎng)。

1.2.2 搖瓶液體培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)：將在PDA斜面培養(yǎng)基中活化后的桑黃菌種，取5mm2（即黃豆大小）接入滅菌后種子液培養(yǎng)基中，150mL／500mL錐形瓶，28℃，130 r／min下?lián)u床培養(yǎng)7d。

液體發(fā)酵：將一定量的中藥水提物加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分溶解混勻，分裝于500mL錐形瓶中，裝液量為200mL，將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌30min。冷卻后以10% 的接種量接入培養(yǎng)基中，在25℃，60r／min搖床中培養(yǎng)5d。每個試驗設3個平行，并設置1組對照試驗（不添加中藥水提物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件相同）。

1.2.3 菌絲生物量的測定

發(fā)酵液經離心，沉淀，用水洗滌3次，再次離心，沉淀的菌絲體，置于65℃的干燥箱內干燥至恒重，稱重得桑黃生物量。

1.2.4 胞外多糖含量的測定

取發(fā)酵上清液，加4倍95%乙醇沉淀，4℃放置24h，3000r／min離心20min，棄去上清液，用85%乙醇洗滌沉淀兩次，3000r／min離心20min棄去上清液。所得沉淀待酒精完全揮發(fā)后，溶于蒸餾水以硫酸-苯酚法進行測定［7］。

2 結果與分析

2.1 中藥提取物對桑黃發(fā)酵的影響

表1 中藥提取物對桑黃深層發(fā)酵的影響

由表1可知，從桑黃發(fā)酵生物量來看，在所試驗的5種中藥水提物中，銀杏葉、苦蕎、薏苡仁對桑黃菌絲體的生長具有較好的促進作用，這3種中藥對應各組的生物量分別是對照組的1.29～1.54倍；金銀花、連翹對桑黃生長具有一定的抑制作用，生物量為對照的61.9%和47.4%。

從桑黃發(fā)酵胞外多糖來看，在所試驗的5種中藥水提物中，銀杏葉、薏苡仁、苦蕎對桑黃胞外多糖的生長具有一定的促進作用，這3種中藥對應各組的胞外多糖分別是對照組的1.16～1.59倍；金銀花、連翹對桑黃胞外多糖生成具有一定的抑制作用，胞外多糖僅為對照的41%和44.5%。

2.2 不同添加量的中藥水提物對桑黃液體發(fā)酵的影響

圖1 不同中藥對桑黃深層發(fā)酵菌絲生物量的影響

由圖1可知，薏苡仁、苦蕎和銀杏葉3味中藥在低濃度時均能促進桑黃的生長，但隨著添加量的增加，其生物量呈現(xiàn)了下降的趨勢，說明這幾味中藥的用量應該控制在一定范圍內，其中薏苡仁和苦蕎的最佳添加量在2%，銀杏葉的最佳添加量在4%。在試驗濃度范圍內，金銀花和連翹隨著濃度的增加，對桑黃深層發(fā)酵菌體生長的抑制作用越明顯。

圖2 不同中藥對桑黃深層發(fā)酵胞外多糖生產的影響

由圖2可知，薏苡仁、苦蕎和銀杏葉3味中藥在低濃度時均能促進桑黃胞外多糖的分泌，但隨著添加量的增加，其胞外多糖都呈現(xiàn)了下降的趨勢，說明這幾味中藥的用量應該控制在一定范圍內，其中薏苡仁和苦蕎的最佳添加量在2%，銀杏葉的最佳添加量在4%。在試驗濃度范圍內，金銀花和連翹隨著濃度的增加，對桑黃深層發(fā)酵菌體生長的抑制作用越明顯。

3 結論

中藥中的成分與藥用真菌的生長代謝間存在著相互作用，因此中藥中的某些成分可能刺激藥用真菌的生長或活性代謝產物的產生［8］。本文開展了添加多種中藥進行桑黃發(fā)酵的試驗研究，對適合桑黃發(fā)酵的中藥種類進行篩選，以期提高桑黃液體發(fā)酵菌絲體生長及其胞外多糖的生產。研究表明，薏苡仁、苦蕎和銀杏葉這3味中藥在低添加量時，不僅對桑黃深層發(fā)酵菌絲體生長有促進作用，還能促進胞外多糖的分泌，隨著添加量的升高，生物量和胞外多糖在一定劑量下都出現(xiàn)了峰值。金銀花和連翹對桑黃桑黃深層發(fā)酵菌絲體生長和胞外多糖的分泌具有一定的抑制作用。至于中藥對桑黃發(fā)酵的影響機理目前尚不清楚，還有待于進一步研究。

［1］ 戴玉成.藥用擔子菌：鮑氏層孔菌（桑黃）的新認識［J］.中草藥，2003，34（1）：94-95.

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［3］ Shone M Y，Kim T H，Sung N J.Antioxidants and free radical scavenging activityof Phellinus baumii（Phellinus of Hymenochaetaceae）extracts［J］.Food Chemistry，2003，82（4）：593-597.

［4］ 呂英華，王建芳，李玉平，等.藥用真菌桑黃的研究進展［J］.蠶業(yè)科學，2009，35（1）：204-210.

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［7］ 張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.杭州：浙江大學出版社，1994.

［8］ 楊海龍，唐華.中藥對藥用真菌深層發(fā)酵的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（4）：128-131.