高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飛高，劉西哲，盧彥芳，趙曉娟，張志清*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050051)

·論著·

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飛高1，劉西哲2，盧彥芳1，趙曉娟1，張志清1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050051)

目的建立測(cè)定艾瑞昔布片劑中艾瑞昔布的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-mass sepectrometry，LC-MS/MS)含量測(cè)定方法。方法樣品經(jīng)甲醇-水(80∶20,V/V)提取，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)后采用LC-MS/MS法測(cè)定其中艾瑞昔布的含量。色譜柱為Waters Symmetry R C18(3.5μm,2.1mm×100mm)，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫；離子源為電噴霧離子化源(ESI源)，離子源溫度為550 ℃，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式分別監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z 370.2～278.2(艾瑞昔布)和m/z 346.1～198.0(內(nèi)標(biāo)奧美拉唑)。結(jié)果艾瑞昔布的監(jiān)測(cè)濃度在31.83～509.34μg/L范圍內(nèi)與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值呈良好線(xiàn)性關(guān)系(r=0.997 6)；平均加樣回收率在95.6%～103.4%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于6.1%(n=9)。結(jié)論該方法快速、靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于艾瑞昔布片劑的質(zhì)量控制。

色譜法，高壓液相；串聯(lián)質(zhì)譜法；艾瑞昔布

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.03.001

艾瑞昔布(imrecoxib)為環(huán)氧化酶2(cyclooxygehase-2,COX-2)選擇性抑制劑，于2011年5月獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市[1-2]。研究結(jié)果[3-7]表明，該藥通過(guò)抑制COX-2mRNA的表達(dá)而發(fā)揮其抗炎作用，對(duì)于急性和慢性炎癥具有潛在的治療作用，同時(shí)具有較高的安全性。艾瑞昔布為新化合物，化學(xué)名稱(chēng)為1-正丙基-3-(4-甲基苯基)-4-(4-甲磺酰基苯基)-2,5-二氫-1H-2-吡咯酮。已有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquidchromatography-masssepectrometry，LC-MS/MS)法測(cè)定生物樣品中艾瑞昔布及其代謝物的含量，制劑含量測(cè)定及質(zhì)量控制方法則未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次建立了靈敏、簡(jiǎn)便、快速的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]用于該制劑的分析檢測(cè)和質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

API4000+型液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源和Analyst1.6.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(ABSCIEX公司)；ProminenceCBM-20A型液相色譜儀，配有二元梯度泵、在線(xiàn)脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣和柱溫箱(日本島津公司)；CPA225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

艾瑞昔布對(duì)照品(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)66311003，純度為99.6%)；奧美拉唑(魯南制藥有限公司，純度為99.7%)；艾瑞昔布片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格0.1g；批號(hào)，11102551、12070351、12100351)；乙腈為色譜純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1LC條件：色譜柱，WatersSymmetryRC18
(100mm×2.1mm，3.5μm)；柱溫，40℃;流動(dòng)相，乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0min，30%A；0～3min，30%→95%A；3～4min，95%A；4min，30%A；4～7min，30%A)；流速0.4mL/min；進(jìn)樣量2μL。

2.1.2MS條件：離子源，電噴霧離子化源(ESI源)；監(jiān)測(cè)方式，正離子監(jiān)測(cè)；離子源噴射電壓5 500V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力10psi；碰撞氣壓力4psi；掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z370.2～278.2 (艾瑞昔布)和m/z346.1～198.0(奧美拉唑)，掃描時(shí)間100ms。

2.2 溶液的制備與測(cè)定方法

2.2.1 供試品溶液的制備：取艾瑞昔布片20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量(0.5g)，置于250mL量瓶中，加水50mL，振搖，加甲醇適量，超聲提取15min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液0.25mL，置于250mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備：取艾瑞昔布對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并稀釋?zhuān)@得濃度為305.6mg/L的對(duì)照品貯備液。取該貯備液適量，加甲醇進(jìn)行系列稀釋?zhuān)@得濃度為1 019.67、509.34、254.67、127.33、63.67μg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 空白溶液的制備：按處方比例稱(chēng)取一定量的不含艾瑞昔布的空白輔料，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備空白溶液。

2.2.4 測(cè)定法：精密量取上述空白溶液、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各0.5mL，分別精密加入濃度為84.7μg/L的奧美拉唑溶液0.5mL，搖勻。取2μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄艾瑞昔布和奧美拉唑的色譜峰峰面積。

2.3 結(jié)果

2.3.1MS條件的選擇：取200μg/L的艾瑞昔布標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10μL/min的速度注入MS/MS儀，分別在正負(fù)離子檢測(cè)模式下記錄艾瑞昔布的一級(jí)MS和二級(jí)MS圖。結(jié)果表明，艾瑞昔布具有較強(qiáng)的正離子信號(hào)，正離子比較穩(wěn)定，因此選擇正離子模式進(jìn)行艾瑞昔布的定量檢測(cè)。分別選定艾瑞昔布和奧美拉唑的監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z370.2～278.2和m/z346.1～198.0。隨后進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，確定了MS檢測(cè)的最佳參數(shù)，包括源噴射電壓(5 500V)、源溫度(550℃)、氣簾氣壓力(10psi)、碰攔氣壓力(4psi)、CE(艾瑞昔布31eV，奧美拉唑14eV)、DP(艾瑞昔布120V，奧美拉唑52V)。

2.3.2 干擾試驗(yàn)：取空白溶液、艾瑞昔布標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各適量，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法采用LC-MS/MS法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。艾瑞昔布和奧美拉唑的保留時(shí)間分別為3.92min和2.63min，空白溶液中未見(jiàn)干擾峰，表明共存組分不會(huì)影響艾瑞昔布的定量檢測(cè)。

2.3.3 線(xiàn)性關(guān)系考察：取艾瑞昔布系列標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖。以艾瑞昔布的檢測(cè)濃度(X)為橫坐標(biāo)，艾瑞昔布和奧美拉唑的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸分析，計(jì)算得回歸方程為Y=0.002 65X+0.040 8(r=0.997 6，n=5)。結(jié)果表明，艾瑞昔布的檢測(cè)濃度在31.83～509.34mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.4 檢測(cè)限(limitofdetection,LOD)和定量限(limitofquantity,LOQ)：取艾瑞昔布對(duì)照品溶液稀釋若干倍，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，根據(jù)S/N≥3∶1，測(cè)得艾瑞昔布的LOD為0.5mg/L；根據(jù)S/N≥10∶1，測(cè)得艾瑞昔布的LOQ為1.5mg/L。

2.3.5 精密度試驗(yàn)：取濃度為254.67mg/L的對(duì)照品貯備液，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，RSD=1.4%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)：取適量樣品6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD=1.2%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12h依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD=1.1%(n=6)，表明艾瑞昔布在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)：取同批樣品細(xì)粉適量(相當(dāng)于艾瑞昔布50mg)，共9份，分別置于50mL量瓶中，加入艾瑞昔布對(duì)照品適量，配制成低、中、高三個(gè)濃度，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery tests (n=9)

RSD：relative standard deviation

2.3.9 樣品含量測(cè)定：取3個(gè)批次的艾瑞昔布片，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of content determination of samples (n=3)

RSD：relative standard deviation

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇：本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相條件，甲醇-水、乙腈-水。發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，峰型不好，形成多重峰。無(wú)論是改變流動(dòng)相比例，還是使用等度、梯度洗脫，狀況均未改善。流動(dòng)相改為乙腈-水時(shí)，峰型有了較好的改觀。本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步考察了不同組成和不同梯度的流動(dòng)相對(duì)分析結(jié)果的影響，使得艾瑞昔布與內(nèi)標(biāo)奧美拉唑的保留時(shí)間適中。結(jié)果表明艾瑞昔布與奧美拉唑可獲得良好地分離，未發(fā)現(xiàn)干擾成分，并且最終運(yùn)行時(shí)間為7min，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。

3.2 內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性:奧美拉唑的結(jié)構(gòu)具有亞磺酰基，是弱堿性化合物，在酸性溶液中容易降解，很快分解為砜化物和硫醚化物；同時(shí)，奧美拉唑溶液的穩(wěn)定性受溫度和光線(xiàn)的影響，應(yīng)低溫、避光、現(xiàn)配現(xiàn)用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件建立了LC-MS/MS法測(cè)定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量，經(jīng)過(guò)方法學(xué)確證，結(jié)果表明本法專(zhuān)屬性好、靈敏度高、線(xiàn)性關(guān)系良好，適用于艾瑞昔布片劑的質(zhì)量控制。

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CONTENTDETERMINATIONOFIMRECOXIBINIMRECOXIBTABLETSBYLC-MS/MS

LIFeigao1,LIUXizhe2,LUYanfang1,ZHAOXiaojuan1,ZHANGZhiqing1*

(1.DepartmentofPharmacy,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveToestablishahighperformanceliquidchromatography-masssepectrometry(LC-MS/MS)methodforthedeterminationofimrecoxibinimrecoxibtablets.MethodsThesampleswerefirstlyextractedwithmethanol-watersolution(80∶20,V/V),andthenfilteredthrough0.22μmmicroporefilm.ThecontentofimrecoxibwasdeterminedbyLC-MS/MS.ThedeterminationwasperformedonWatersSymmetryRC18(3.5μm,2.1mm×100mm)columnwithgradientelution.Themassspectrometerwasoperatedinthepositiveionizationelectrospray(ESI)modeusingmultiplereactionmonitoringforanalysisofimrecoxibat550℃.Thetransitionsofm/z370.2-278.2(imrecoxib)andm/z346.1-198.0 (omeprazole)wereusedtoquantifyimrecoxibandomeprazole.ResultsThelinearrangeofimrecoxibwas31.83-509.34μg/L(r=0.997 6)andthemethodrecoverywaswithin95.6%-103.4% (RSD<6.1%,n=9).ConclusionThemethodisrapid,sensitiveandaccurate,anditissuitableforthequalitycontrolofimrecoxibtablets.

chromatography,highpressureliquid;tandemmassspectometry;imrecoxib

2013-05-20；

2013-08-28

李飛高(1985-)，男，河北邢臺(tái)人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥師，理學(xué)碩士，從事臨床藥學(xué)、藥物新制劑研究。

*通訊作者。E-mail：777yyy@sina.cn

R446.1

A

1007-3205(2014)03-0249-03

劉斯靜)