響應面法優化靈芝胞外多糖的發酵工藝條件1)

程俊文，賀亮*，李肖娟，胡傳久，魏海龍，付立忠，李海波

(1.浙江省林業科學研究院，浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，杭州310023；2.杭州雪域生物技術有限公司)

靈芝(Ganodermalucidum)是一種藥用價值很高的名貴真菌，現代醫學研究已證實：靈芝對多種疾病尤其是癌癥、心臟病、腦血栓等嚴重威脅人類生命的疾病具有十分顯著的療效[1]。近年來，隨著人們生活水平和保健意識的提高以及相關產品開發的拓展，僅靠野外采集或人工栽培子實體已不能滿足人們對靈芝的需求，因而利用液體深層發酵技術大量而且快速地生產靈芝發酵產物的方法得到了普遍應用[2]。

響應曲面法(response surface methodogy，RSM)是建立一個包括各因素的一次項、平方項和任何兩個因素之間的一級交互作用項的數學模型。近年來日益受到重視, 該方法采用可以建立連續變量曲面模型，對影響生物產量的因子水平及其交互作用進行優化與評價，從而快速有效地確定生物過程的最佳條件。目前該方法現已廣泛用于發酵培養基優化、培養條件優化和酶解等生化反應優化和模型建立中[3-4]。本實驗以靈芝胞外多糖為目標產物，利用Box-Behnken設計和響應面法優化發酵培養基組成來提高靈芝液體發酵胞外多糖的產量，為以后的發酵和放大實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

靈芝(Ganodermalucidum)：由浙江省林業科學研究院生物技術研究所實驗室保藏。

1.2 培養基

1.2.1 斜面PDA活化菌種用。

1.2.2 液體種子培養基。馬鈴薯100g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/ L。

1.2.3 搖瓶發酵基礎培養基。葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L。

1.3 培養方法

1.3.1 斜面培養。從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于斜面的中部，在25℃培養7d。

1.3.2 液體種子培養將活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種于液體培養基中，500mL 三角瓶裝培養基150mL于25℃，150r/min培養7d。

1.3.3 發酵培養。采用二級搖瓶，500mL三角瓶裝液量150mL，液體菌種接種量為10%，于25℃，150r/min培養。

1.4 實驗設計

1.4.1 單因素實驗

以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、小麥粉取代搖瓶發酵培養基中的葡萄糖，分別進行碳源種類試驗；以酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、麥麩、牛肉浸膏取代酵母粉，分別進行氮源種類試驗；以10～30g/L葡萄糖進行碳源濃度梯度試驗，以2～16g/L的酵母粉進行氮源濃度梯度試驗。

1.4.2 響應面法分析實驗

綜合單因素試驗結果，選擇葡萄糖、玉米粉、豆餅粉3個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理[5]，采用3因素3水平的響應面設計，利用DesignExpert8.05軟件對實驗數據進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面分析因子及水平表

1.5 分析方法

1.5.1 菌絲干重測定

取100mL發酵液，在3000r/min離心20min，經自來水洗滌多次后，將菌絲體在105℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.5.2 胞外多糖(extracellular polysaccharides，簡寫EPS)的測定

收集發酵液，3000r/ min離心20min，取上清液，濃縮，加入3倍體積的95%酒精，4℃冰箱醇沉24h，4000r/min離心20min得沉淀物，用硫酸-苯酚法測定其多糖的含量[6]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

表2 不同碳源對靈芝液體發酵胞外多糖的影響

表3 起始碳源濃度對菌絲體生物量和胞外多糖產量的影響

表4 不同氮源對靈芝液體發酵胞外多糖的影響

表5 起始氮源濃度對菌絲體生物量和胞外多糖產量的影響

表2～表5的結果說明：葡萄糖、玉米粉和小麥粉都是較好的碳源，其含量對靈芝胞外多糖的積累隨著濃度的增加而增大，繼續增大則趨于平穩；從生產實際考慮，選擇葡萄糖和玉米粉作為靈芝液體發酵培養基的復合碳源。酵母粉和豆餅粉都是較好的氮源，其含量對多糖的積累隨著濃度的增大而增大，繼續增到一定值反而降低；從生產實際考慮，豆餅粉價格低廉，容易獲得，因此選擇豆餅粉作為靈芝液體發酵培養基的氮源。

2.2 響應面分析試驗結果

2.2.1 響應面分析方案及結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計3因素3水平的響應面分析試驗。共有17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗用以估計試驗誤差。以胞外多糖得率為響應值，試驗方案及結果見表6。

表6 響應面試驗設計方案及試驗結果

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

利用Design Expert 8.05軟件對表6實驗數據進行分析[7]，獲得靈芝胞外多糖得率對葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的多元二次回歸方程：EPS(mg·L-1)=341.36+4.81X1+8.61X2+22.55X3-6.95X1X2+12.28X1X3-9.36X2X3-37.26X1X1-19.97X2X2-19.96X3X3

表7 回歸模型方差分析

由表7方差分析可知，以胞外多糖含量為目標函數的回歸方程的回歸效果達到極顯著水平，P值均<0.0001；模型的決定系數R2=0.9879，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數AdjR2=0.9724，說明該模型能解釋97.24%響應值的變化；模型的失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，表7中模型失擬項的P值為0.0956，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據表7的顯著性分析結果，各因素的一次項、二次項以及X1X2、X1X3、X2X3的交互項對胞外多糖的合成均顯著(P<0.05)影響；綜合以上表明這個模型建立的回歸方程能運用于靈芝液體發酵培養基優化的理論預測。

2.2.3 響應面圖形分析

分別將模型中的葡萄糖、玉米粉及豆餅粉的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結果，二次回歸方程的響應面及其等高線如圖1～3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應值的影響結果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響靈芝發酵產胞外多糖最顯著的因素為葡萄糖(X1)，表現為響應面變化弧度較大。玉米粉(X2)和豆餅粉(X3)響應面弧度變化平緩，說明對響應值影響相對較小。此外，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1～圖3可以看出，X1與X3交互作用顯著；X2與X3，X1與X2均無交互作用，表明一因素對響應值的影響規律并不會隨著另一因素的改變而有明顯變化。

圖1 葡萄糖和玉米粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

圖2 葡萄糖和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

圖3 玉米粉和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

2.2.4 驗證實驗

通過SAS軟件對上述方程進行求解，得到最佳培養條件為：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆餅粉10.41 g/L，胞外多糖產量理論值可達348.75mg/L。

為檢驗模型預測值與實際實驗值之間的相關性，即檢驗響應面優化模型的可靠性，對靈芝在預測的最優發酵條件下胞外多糖產量進行實驗驗證。實驗中葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的優化值分別為15.79、10.23、10.41g/L，三組平行實驗，測得胞外多糖產量分別為338.79mg/L、341.04mg/L、340.32mg/L，實際胞外多糖平均值為340.05mg/L，達到了回歸模型預測理論值的97.5%，實驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預測靈芝胞外多糖產量。

3 結論

考察了不同碳、氮源營養因子的影響，結合工業化生產實踐，選擇葡萄糖和玉米粉為碳源，豆餅粉為氮源，根據Box-Benhnken中心組合實驗設計及三因素三水平的響應面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預測了靈芝產胞外多糖最佳培養基條件為：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆餅粉10.41g/L，胞外多糖產量理論值可達348.75mg/L。驗證實驗中胞外多糖可得340.05mg/L，與預測值十分接近，證明了該實驗方法的穩定性。

[1]馬禮金,姚汝華.靈芝的藥用及食用研究[J].食品與發酵工業,2005,24(1)：62-66．

[2]夏至蘭，周連玉,劉明月．靈芝深層發酵優良菌株的篩選[J].菌物研究，2007，5(2)：75-80．

[3]呂國英,張作法,潘慧娟,等.響應面分析法優化香菇多糖發酵培養基[J].菌物學報,2010, 29(1): 106-112.

[4]王允祥,呂鳳霞,陸兆新.杯傘發酵培養基的響應曲面法優化研究[J].南京農業大學學報,2004, 27(3): 89-94.

[5]Liang RenJie. Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers 2008,74:858-861.

[6]王光亞.保健食品功效成分檢測方法[M].北京:中國輕工業出版社,2002.

[7]費榮昌.實驗設計與數據處理[Z].4版.江南大學教材,2001:59-63.