慢病毒載體過表達SATB1蛋白對乳腺癌細胞侵襲性的影響

孫正魁 張 超 鄒學森 徐宗全 姜桂香 董 赟

特殊富含AT序列結合蛋白1(special AT rich sequence binding protein,SATB1)的表達與乳腺癌的不良預后和化療耐藥相關[1]，本研究構建人SATB1 基因慢病毒表達載體，評價其在乳腺癌細胞中的表達水平和對乳腺癌細胞侵襲性的影響，為進一步研究SATB1 在乳腺癌中的作用及機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養基(Gibco，美國)；胎牛血清(Hy-clone，美國)；GV287 載體(含綠色熒光蛋白GFP)、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體、293T細胞、PCR引物(上海吉凱基因技術有限公司)；Taq 聚合酶(Takara，日本)；QIAGEN Plasmid 大抽Kit(QIAGEN，德國)；瓊脂糖(北京賽百盛基因技術有限公司)；DNA ladderMarker(上海捷瑞生物工程有限公司)；T4 DNA 連接酶、AgeⅠ、BamHⅠ(NEB，美國)；脂質體Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)；Western blot 檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；SATB1單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)。

1.2 方法

1.2.1 SATB1 基因獲取和真核表達載體酶切 參考GeneBank 的SATB1 基因序列(NM-002971.4)設計出合成一對SATB1 基因引物。引物序列：上游引物5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGATCATT

TGAACGAGGCAAC-3'，下游引物5'-TCCTTGTAGTCCATACCGTCTTTCAAATCAGTATTAATGTC-3'。抽提人SATB1cDNA，并以此為模板進行PCR 擴增。

1.2.2 GV287-SATB1 重組質粒構建、擴增、鑒定 通過限制性內切酶AgeⅠ(ACCGGT)和BamH Ⅰ(GGATCC)使慢病毒表達質粒GV287 載體線性化，通過T4 DNA 連接酶將線性化的載體和DNA 構建為帶有目的基因SATB1 序列的質粒載體。連接后的重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，培養篩選后，挑取單克隆并擴大培養以進行PCR 鑒定及測序。

1.2.3 病毒顆粒包裝和濃縮 將對數生長期的293T細胞接種于細胞培養皿，培養24 h使密度達70%～80%，加入所制備的各DNA溶液(GV287-SATB1 20 μg，pHelper 1.0載體15 μg，pHelper 2.0載體10 μg)、相應體積的Opti-MEM、Lipfectamine 2 000試劑(100 μl)。收集轉染48 h后的293T細胞上清液。離心除去細胞碎片，過濾上清液，離心得到需要的病毒濃縮體積。分裝保存病毒濃縮液，-80℃保存。

1.2.4 病毒轉染MCF-7細胞 取處于對數生長期的MCF-7細胞接種于6 孔培養板中，待細胞生長融合約70%左右進行轉染。共分為3 組：MCF-7細胞對照組；轉染單純含GFP 病毒液組；轉染含有目的基因SATB1組。轉染條件：每孔1 mL培養基，含10% 胎牛血清，109 TU/mL 病毒液(7 μL)，轉染12 h 后倒去培養基，PBS 清洗，加入2 mL完全培養基，48 h后更換完全培養基，熒光顯微鏡下檢測轉染效率。大量擴增細胞，備用。

1.2.5 Western blot 檢測SATB1 蛋白表達 以細胞裂解液裂解篩選后的細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白的濃度，制備SDS-PAGE 膠，每泳道加入20 μg總蛋白，電泳。轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗(SATB1單抗)孵育，4 ℃過夜，次日室溫下1 h，PBST 清洗5次，5 min/次，加二抗，室溫2 h，PBST 清洗3次，10 min/次;入化學發光劑，暗房曝光。

1.2.6 侵襲實驗 采用Transwell小室，取上述3組的細胞，胰酶消化后用DMEM培養液懸浮。調整細胞密度至2.5×105/mL，加200 μL細胞懸液至上室，下室加入30%胎牛血清的DMEM培養液600 μL，每株細胞設3個復孔，24 h后用0.1%結晶紫染色，觀察穿過Transwell小室的細胞數量，作為評價侵襲能力的指標。顯微鏡下計數每個小室的穿膜細胞數，實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 PCR 擴增SATB1

PCR 成功擴增出SATB1 序列的DNA 片段，電泳可見大小約2 333 bp 的特異性條帶(圖1)。

SATB1為2333bp的擴增條帶，M為Marker。

2.2 重組質粒的鑒定

提取重組質粒，以KL5911-P3 / EGFP-N-R為引物進行PCR 擴增，得到910bp 的擴增產物，即陽性克隆(圖2) 。陽性克隆測序由上海吉凱基因技術有限公司完成，測序結果與目標序列完全一致。

a為陰性對照(ddH2O)；b為陰性對照(空載體自連對照組)；c為陽性對照(GAPDH)；M為Marker；1～5分別為SATB1 1～5號轉化子。

圖2 電泳鑒定PCR 產物

2.3 轉染MCF-7細胞后熒光顯微鏡觀察結果

以完全培養基篩選2周后大量擴增細胞，倒置熒光顯微鏡(×200)觀察發現，轉染后的大部分細胞均有GFP 表達，轉染效率達70%以上(圖3)。

圖3 轉染后熒光表達情況(免疫熒光×200)

2.4 Western blot 檢測SATB1 表達

將轉染后的細胞提取總蛋白，β-actin 作為內參，結果顯示SATB1 轉染組較空白對照組及GFP對照組SATB1表達水平明顯上調(圖4)。

Cont為空白對照；GFP-cont為GFP 空質粒轉染組；SATB1為目的基因轉染組。

圖4 Satb2 表達的Western bolt 結果

2.5 SATB1過表達對MCF-7細胞侵襲性的影響

采用Transwell法檢測轉染GV287-SATB1的MCF-7細胞的穿膜能力，結果顯示SATB1 轉染組較空白對照組及GFP對照組的穿膜細胞數顯著增加，P<0.01(圖5)。

Cont為空白對照；GFP-cont為GFP 空質粒轉染組；SATB1為目的基因轉染組。

圖5 SATB1過表達對MCF-7細胞侵襲性的影響

3 討論

乳腺癌的發病率逐年上升，現居女性惡性腫瘤首位[2]。采用目前治療方法，療效仍不盡如人意，重要臟器的轉移是造成乳腺癌死亡的原因，與乳腺癌侵襲轉移相關的生物學標志物是目前乳腺癌研究的熱點。

SATB1是1種組織特異性表達的核基質結合蛋白，編碼基因位于3號染色體3P23區，能以非常高的親和力與核基質結合區的ATC序列相結合，參與染色質重塑、DNA甲基化和組蛋白乙酰化，調控多種基因表達[3]。Han等用免疫組化的方法發現在人乳腺癌組織細胞核中有SATB1的異常顯著表達，進一步研究發現表達水平不僅與乳腺癌的惡性程度呈正相關，而且在其表達的同時能上調乳腺組織中1000余種基因的表達，可能成為控制乳腺癌轉移的關鍵蛋白[4]。因此，研究SATB1在乳腺癌組織中的生物功能具有十分重要的意義。

慢病毒表達載體轉染細胞具有能夠轉染非分裂期細胞，體內較長期穩定的表達，免疫反應小，安全性較好等優點[5]。本研究成功構建表達SATB1蛋白的慢病毒載體GV287-SATB1。該慢病毒載體使用的病毒包裝系統由GV287、pHelper 1.0和pHelper 2.0組成。其中，GV287質粒中含有PUbi啟動子，能在宿主細胞中持續表達SATB1，同時該質粒能表達由PSV40啟動子驅動的GFP，可用于病毒包裝時轉染效率及感染目的細胞的感染效率的檢測，pHelper1.0和pHelper2.0載體則表達病毒結構和包裝所需要蛋白。

本研究采用的MCF-7乳腺癌細胞株是從一例69歲的白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立的，該細胞保留了多個分化乳腺上皮的特性，表達雌激素受體，侵襲性較弱[6]，是在乳腺癌研究中被廣泛應用的代表性細胞株。我們發現GV287-SATB1慢病毒載體能夠被高效率的轉染MCF-7細胞并在MCF-7細胞中過表達SATB1蛋白，過表達SATB1的MCF-7細胞侵襲性顯著增強。為進一步研究SATB1基因對人乳腺癌細胞生物學行為的影響并探討其機制奠定基礎。

[1] Yamayoshi A,Yasuhara M,Galande S,et al.Decoy-DNA against special AT-rich sequence binding protein 1 inhibits the growth and invasive ability of human breast cancer〔J〕.Oligonucleotides,2011,21(2):115-121.

[2] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[3] Yamasaki K,Akiba T,Yamasaki T,et al.Structural basis for recognition of the matrix attachment region of DNA by transcription factor SATB1〔J〕.Nucleic Acids Res,2007,35 (15):5073-5084.

[4] Han HJ,Russo J,Kohwi Y,et al.SATB1 reprogrammes gene expression to promote breast tumour growth and metastasis〔J〕.Nature,2008，452 (7184):187-193.

[5] Naldini L,BlomerU,Gallay P,et al.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector〔J〕.Science,1996,272(5259):263-267.

[6] Lacroix M,Leclercq G.Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours:an update〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2004,83(3):249-289.