二價金屬離子轉運體在錳轉運過程中的作用

焦翼飛，李濤，曾水林

(東南大學醫學院 人體解剖與組織胚胎學系，江蘇 南京 210009)

二價金屬離子轉運體(divalent metal-ion transporter-1，DMT1)是一種在哺乳動物中廣泛表達的金屬離子轉運體，參與機體內多種金屬離子的轉運(以鐵和錳為主)。相關研究已證實，金屬離子、氧化還原物質、炎癥反應等因素均可影響DMT1基因的表達。DMT1還可能與腦內神經元變性有關。深入研究DMT1將為了解金屬離子代謝及其相關疾病的發病機制提供重要的研究資料。正常生理條件下，錳(Mn)是機體必需的金屬元素，對維持大腦正常功能起到重要作用。Mn過多或缺乏會對機體產生有害的影響。Mn能選擇性蓄積在腦內，作用于錐體外系，因此，Mn中毒可引起類帕金森癥狀。近年來，越來越多的實驗室在研究細胞(尤其是神經元)攝取和轉運Mn的機制，結果顯示DMT1在Mn轉運過程中可能起著至關重要的作用。

1 二價金屬離子轉運體

二價金屬離子轉運體又稱為自然抵抗相關巨噬蛋白2(natural resisitance associated macrophage protein 2，Nramp2)，或二價陽離子轉運體1(divalent cation transporter 1，DCT1)，屬于可溶性載體家族成員(solute carrier family 11member 2，SLC11A2)，是哺乳動物體內質子偶聯的跨膜金屬離子轉運體。它于1995年首次被發現，因與已經發現的Nramp1基因同源性高達78%，所以被命名為Nramp2[1]。自發現DMT1以來，在它的結構、分布、功能等方面研究已經獲得很多重要進展，對于DMT1的研究已經成為整個微量元素研究領域的一個熱點問題。

1.1 DMT1分子的結構

DMT1分子量為61456，等電點(isoionic point，pI)為6.02，是具有12個跨膜結構域(transmemberane，TM)的糖蛋白，其糖基化的細胞外袢狀結構和高度保守的細胞內序列都具有高度的疏水性。DMT1信使核糖核苷酸(mRNA)的4種亞型在不同組織和細胞編碼4種不同的DMT1蛋白并行使不同的功能。其中的2個在最后1個外顯子中含有IRE(iron-responsive element)序列，其他2個則沒有；因此C末端DMT1蛋白亞型被分為Ⅰ(+IRE)和Ⅱ(-IRE)。人DMT1基因組DNA含有43 999個堿基，包括16個外顯子，其cDNA有4 142個堿基，所編碼蛋白含561個氨基酸，其羧基端和氨基端都位于細胞胞質內。DMT1與同家族Nramp1的基因同源性高達78%，氨基酸相似性達到64%，二者的主要區別在于氨基端的不同[2]。Lee等[3]研究發現與Nramp1基因相比，DMT1在氨基端多出1個外顯子和內含子1，并在羧基端多出了外顯子17和內含子16，故推測兩者在結構和功能上的差別可能與此有關。

1.2 DMT1分子的分布

DMT1在體內的表達具有組織和細胞特異性，且不同的亞型在各個器官的表達和功能上都有所不同。DMT1亞型在成人組織中普遍存在，而DMT1(+IRE)和DMT1(-IRE)卻具有細胞型特異性和亞細胞分布特異性。相關研究表明，在胚胎組織中DMT1(+IRE)和DMT1(-IRE)的表達是普遍存在的，并且兩種亞型的蛋白都集中在胚胎上皮細胞膜上，這與所在組織的吸收或排泄功能相關。其中，DMT1(-IRE)存在于神經元、神經樣細胞、星形膠質細胞以及星形細胞瘤的細胞核和細胞質中，而DMT1(+IRE)主要存在于在這些細胞的細胞質中[4]。

1.3 DMT1分子的功能

DMT1的生物學效應的首次發現是基于對兩種動物模型[microcytic(mk) mice和Belgrade(b/b) rats]的表型分析，它們發生了自發的突變導致，DMT1基因的第4個跨膜結構域的第185號殘基從甘氨酸突變成精氨酸[5]。兩種動物都表現出小紅細胞性貧血，這和鐵轉運體的破壞有關，進而導致了體內錳的失衡。類似的，人類含有不同區域突變的DMT1,如E399D[6]、R416C[7]或者G212V[8]也都表現出小紅細胞性貧血，這提示我們DMT1在哺乳類動物中功能上可能的共性。

Salazar等[9]對帕金森(PD)患者死后的腦組織行免疫組織化學檢測發現,在其黑質(SN)中DMT1的表達量增加;在MPTP染毒的小鼠腹側中腦發現DMT1+IRE表達量上調，并且發現含有DMT1突變體的小鼠有部分的抗MPTP毒性的神經保護功能。陳瑛等[10]用乳胞素誘導神經元(SH-SY5Y)細胞系的損傷進而檢測DMT1表達量的改變時發現，乳胞素處理組DMT1的表達量明顯增加。這提示我們，DMT1可能和腦以及神經元的損傷有密切的關系。

現階段，有兩種理論來解釋DMT1發揮功能的機制：(1) 不依賴于轉鐵蛋白受體(TfR)通路；(2) 依賴于轉鐵蛋白受體(TfR)通路。在不依賴于轉鐵蛋白受體通路中，DMT1能夠作為一個協同轉運體將金屬離子的向內運輸和質子的向外運輸結合起來。對爪蟾卵母細胞的電生理研究顯示,在中性膜電位和pH環境下，DMT1以1∶1的速率轉運質子和金屬離子。降低膜電位或pH值都可以提高DMT1對金屬離子的轉運速率。這種緊密的關系可以保護細胞免受含過量金屬或酸性環境的危害[11]。DMT1和TfR的共區域化預示著由DMT1攝取錳的通路中肯定有一條是受TfR調節的。當金屬離子如鐵或者錳結合到轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體復合物上，由于內吞作用金屬離子由細胞質膜轉運到細胞質基質中，然后Ⅴ型ATP酶活化導致吞噬泡變酸進而金屬離子從復合物中解離,這會反過來活化吞噬泡膜上的DMT1協同運輸金屬離子和質子，正如圖1[12]所示。

圖1通過血腦屏障攝取錳的分子機制(來自文獻[12])

2 錳

錳是地殼中廣泛分布的一種元素。錳一般以氧化物、碳酸鹽和硅酸鹽的形式存在。錳還是動物生理機能不可缺少的7種必需金屬元素之一。作為一種人體的必需微量元素，錳是轉移酶、水解酶、裂合酶、精氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、超氧化物歧化酶等多種酶的活性基團或輔助因子[13]。錳通過對這些酶的調控參與體內多種生理代謝過程，如免疫調節、細胞黏附、蛋白質和碳水化合物的新陳代謝等。錳在神經元生長發育及骨骼形成中亦發揮重要作用[14]。錳缺乏時，機體會出現糖類、脂類的代謝異常，骨骼畸形，生長停滯，生殖功能異常，中樞神經系統功能障礙等[15]。

盡管錳對于新陳代謝的功能是必需的，但是過多地暴露在富含錳的環境中是很危險的，吸入含錳顆粒物和肺部炎癥有關，在人和靈長類中主要表現是咳嗽、支氣管炎、肺炎和肺功能受損[16]，在嚙齒類動物中表現為鼻上皮組織炎癥[17]。暴露在高錳環境中的男性員工被報道出可能會陽痿和失去性欲[18]，可能是由于精氨酸酶在這些功能中起著重要的作用。雖然大多數的錳是從食物中獲得的，但由飲食造成的錳中毒是很罕見的[19]，這是由于機體中有腸上皮細胞的吸收和膽管細胞的排泄兩條途徑很好地調節錳的平衡。相比較而言，嗅球對微粒錳的攝取和轉運可以導致錳在紋狀體和小腦中沉積及鼻上皮組織的炎癥[17]。職業暴露在錳環境中6個月到2年會引起錐體束外的綜合征，被稱為錳中毒，不管在分子水平還是臨床水平和先天性帕金森病都極其相似[20]。錳中毒是一種伴隨著步態紊亂的帕金森綜合征。遭受錳中毒的患者表現出兩相的身體機能下降的特征，初始相是精神上的憂慮包括情緒的異變、情感的缺乏，隨之而來的第二相是動力缺乏，比如運動能力下降、肌張力障礙和運動遲緩[21]。錳暴露是一個顯著的公共健康問題，錳作催化劑被廣泛用于數不盡的工業生產方法中以及作為汽油的添加劑，作為像代森錳一樣的除菌劑，用來凈化飲用水的高錳酸鹽里也含有錳。這些使得錳中毒在非職業錳暴露下也時有發生。

近年來，隨著納米材料的廣泛使用，尤其是含錳納米材料由于具有其獨特的電化學性能如減小極化，增大充放電電流密度，具有優良的離子傳導性和較高的電位等得到了非常廣闊的應用前景。錳暴露的環境問題越來越嚴重，研究[22-23]表明一些人造納米顆粒很容易引起靶器官炎癥，導致大腦損傷；使機體產生氧化應激效應；容易進入細胞甚至細胞核內；有隨尺寸減小而生物毒性增大的趨勢。納米錳顆粒作為一種外源性化合物進入到中樞神經系統之后，必然會引起腦組織內相應細胞的功能改變[24]。Oszlanczi等[25]將大鼠暴露在含一定量納米錳的環境下，一段時間后發現大鼠均表現出神經毒性反應,如靜止活動增多，步態紊亂，神經末梢傳導速度顯著地降低等。Oszlanczi等[26]還將大鼠暴露在等量的不同狀態的無機錳(MnO2和MnCl2)環境下，發現MnCl2的神經毒性大于MnO2，可能是因為在MnCl2中錳處于離子狀態更容易被吸收和轉運。毛彩霞等[27]研究納米錳和常規錳對HeLa細胞的毒性效果發現，納米MnO2對HeLa細胞DNA的損傷顯著高于常規MnO2，提示MnO2顆粒的大小與其毒性效應直接相關:在一定范圍內，顆粒尺寸越小，DNA損傷效應越大。

目前，錳過量引起神經毒性的機制已經有一些研究結果，如造成氧化應激、引起線粒體功能異常、凋亡信號Caspase的活化等，但錳轉運到大腦的機制仍然不清楚。在過去的二十年里，人們發現了各種各樣的轉運機制，比如主動運輸和易化擴散。近年來發現錳可以通過高親和力的金屬離子轉運體(如鈣和鐵的轉運體)進行運輸。這些轉運體中包括：二價金屬離子轉運體DMT1，屬于天然抗性相關巨噬細胞蛋白NRAMP家族[28]；ZIP-8，可溶性載體39家族的一員[29]；轉鐵蛋白受體(TfR)，主要負責對三價的鐵離子的轉運[30]；電壓調節和鈣庫操縱性鈣離子通道[31]；離子交換的谷氨酸鹽受體鈣離子通道[32]。其中DMT1對錳的轉運起著至關重要的作用，也是當前的研究熱點。

3 DMT1在錳轉運中的作用

1997年Chua等[33]發現,b/b型大鼠網織紅細胞以及一些器官(如腎臟、大腦和股骨)對錳的攝取和十二指腸對錳的吸收,相對于野生型大鼠(+/+)和雜合子大鼠(+/b)中顯著減少，提示b/b型大鼠錳代謝的破壞是由于DMT1的突變導致錳攝取和轉運的不足。Knopfel等[34]在對小腸膜囊泡進行的研究也驗證了這一觀點。最直接驗證DMT1是否對錳的轉運起作用的方法是,當環境中錳含量很高時檢測DMT1表達量的變化。Garcia等[35]對幼大鼠進行高錳食譜的喂養的體內實驗表明,大鼠腦中DMT1表達量上升了35%。這種含量的升高不是區域特異性的，盡管如此，這個實驗仍然是食物中錳含量的升高伴隨著DMT1表達量升高的一個很好的直接證據。此外，這種關聯在體外實驗中也得到了證實。Wang等[36]在對永生的脈絡叢上皮細胞Z310細胞系錳暴露24 h和48 h后，DMT1的表達量分別上升了45%和78%，并且他們的研究還發現：(1) 暴露在高錳的環境下DMT1的表達量升高；(2) DMT1 mRNA的含量也升高；(3) 鐵調節蛋白和DMT1 mRNA的蛋白-RNA結合位點結合使mRNA的結構穩定，增加DMT1的表達量；(4) DMT1的核不均一RNA的含量并不升高。研究結果顯示，DMT1通過鐵調節蛋白和其mRNA的結合使mRNA更加穩定而不是增加其基因的轉錄進而達到DMT1蛋白的表達量的上調。高錳環境下，可以誘導炎癥等的發生，而炎癥因子可以刺激DMT1表達量的升高[37]，也可能是細胞中錳含量升高的一個因素。Bai等[38]用不同來源的錳來研究DMT1的作用發現,DMT1對有機錳(和氨基酸結合的錳)的轉運遠遠大于對MnSO4的轉運，說明不同來源的錳的毒性應該也不同，并且證實了錳存在的條件下DMT1 mRNA的表達量會增加。He等[39]對中國漢族192名PD患者和193名健康對照用限制性片段長度多聚酶鏈式反應(PCR-RFLP)檢測一個突變體(1303C/A)和兩個單核苷酸多態性(SNPs)位點(1254T/C和IVS4+44C/A),對10%的樣本進行直接的基因組測序來獲得其基因組分型,結果在等位基因或突變基因或PD患者中基因型沒有發現顯著地差異，然而，一個單體型(1254T和IVS4+44C/A都變成C)在PD患者中較對照組中出現的頻率增多(18.2%對11.4%，OR值1.72，95%可信區間1.15～2.59，P=0.01)。這些結果提示，在這些人群中DMT1基因型CC可能是PD的一個危險因子。最近對嗅球中DMT1的研究[40]顯示，在b/b型大鼠中鼻對錳的吸收顯著減少，在鐵缺乏大鼠的嗅球中DMT1的含量升高，可能鐵在DMT1對錳的吸收過程中也起著重要的作用。

綜上所述，細胞通過膜表面的DMT1攝取并轉運外環境的錳，DMT1會隨著錳含量的升高而表達量上調，錳進入細胞體內損傷細胞，從而導致一系列的疾病(如PD等)。此外，DMT1隨著年齡的升高而表達量升高[41]，這是老年人群更容易患PD的一個可能的原因。

4 展 望

由于DMT1轉運錳的機制并沒有完全明了，DMT1攝取錳的精確的途徑和明確的機制都需要進一步的實驗來探究,以下4個方面應該得到重視：(1) 鐵似乎在DMT1轉運錳中起著某種作用，眾所周知，鐵和錳對人體都非常重要，且過量都會有毒性，深入探討鐵是否對DMT1轉運錳有影響，可以更好地理解微量元素在腦內的轉運過程；(2) 在不人為地增加錳含量條件下，上調DMT1的表達，是否會對日常飲食中錳的攝取增多，如果增多，那毫無疑問DMT1在錳的轉運中起著至關重要的作用；(3) 錳累積之后應該會有補償的排除錳的機制，從而減輕錳的毒性，到目前為止還沒有研究錳的排出途徑的報道，如果可以人為地加強這些補救途徑也許對職業錳中毒的患者會有好的療效；(4) 一些新的研究方法如晶體學，三維立體研究DMT1的功能，可能會對DMT1轉運金屬離子的機制有更進一步的了解。

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