孕鼠暴露低劑量鄰苯二甲酸二己酯對仔鼠脂肪分布的影響

劉莉，劉慧敏，顧海倫，趙越，楊軍

(1.中國醫科大學公共衛生學院 營養與食品衛生學教研室，遼寧 沈陽 110001；2.中國醫科大學附屬盛京醫院 骨外科，遼寧 沈陽 110004)

鄰苯二甲酸酯是一種環境內分泌干擾物，主要作為聚氯乙烯塑料的柔軟劑用于醫藥裝置、食品包裝、兒童玩具等[1]，為人群所廣泛接觸。關于其研究大多集中在生殖毒性、胚胎毒性等方面，而在脂肪分布方面的研究則較少。流行病學調查顯示，脂肪堆積的部位差異與慢性病的發病風險密切相關。脂肪蓄積于臀、股部者罹患糖尿病、高脂血癥等慢性疾病的風險較小，而脂肪過多蓄積于內臟者則更傾向于罹患上述疾病。研究發現，鄰苯二甲酸酯暴露和腹部肥胖及胰島素抵抗之間存在聯系[2]，提示其可能對肥胖及脂肪分布產生影響。有證據顯示，脂肪儲存的部位特異性是每個儲存部位脂肪細胞特性的內在差異[3]以及它們發育起源趨異的結果[4]。胚胎期鄰苯二甲酸酯的暴露可永久改變基因表達模式，影響代謝過程[5]。胚胎發育與模式特異性基因磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4(glypican 4，Gpc4)和Tbox-15(Tbx15)的表達具有部位特異性，在人和嚙齒類動物的體脂分布方面發揮重要調控作用[6]。因此，本研究擬以鄰苯二甲酸酯類中應用最廣泛的一種物質鄰苯二甲酸二己酯(di-2-ethylhexylphthalate，DEHP)為代表，通過喂飼C57BL/6J孕鼠含有低劑量的DEHP飼料，觀察其對仔鼠內臟及皮下脂肪組織Gpc4、Tbx15mRNA表達的影響，為闡明脂肪分布的調控機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

實時熒光定量PCR儀(美國ABI PRISM7500)，高速臺式離心機(德國eppendorf centrifuge 5415D)，紫外可見分光光度計(德國Nanophotometer IMPLEN)，超低溫冰箱(美國THERMO SCIENTIFIC FORMA 994)。

1.2 試劑

DEHP(美國Sigma公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，real-time RT-PCR試劑盒(TaKaRa大連寶生物公司)，引物(TaKaRa大連寶生物公司)，液相Erasol(四川天澤基因公司)。

1.3 動物分組

C57BL/6J小鼠(20只雌性，10只雄性)，清潔級，購于中國醫科大學實驗動物部，動物合格證號SCXK(遼)2008-0005。晚8:00按雄雌鼠比例1∶2合籠，第2天早8:00觀察雌鼠陰栓產生情況，有陰栓者為懷孕第1天，將其分為2組。對照組喂飼基礎飼料，DEHP組喂飼添加質量分數為0.06% DEHP的基礎飼料，直至仔鼠出生。所有孕鼠均自由飲水，每周稱質量。仔鼠出生后3周斷乳，喂飼基礎飼料，出生9周后，處死仔鼠，切取附睪周圍(作為內臟脂肪組織的代表)和腹股溝處(作為皮下脂肪組織的代表)脂肪組織，稱質量，凍存待測。

1.4 仔鼠附睪和皮下脂肪組織Gpc4、Tbx15 mRNA表達

采用real-time RT-PCR測定mRNA表達：TRIzol提取總RNA，逆轉錄總反應體系為20 μl[包括5×PrimeScript Buffer 4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl，Oligo dT(50 μmol·L-1)1 μl，Random 6 mers(100 μmol·L-1)1 μl，樣品RNA 500 ng，補足RNase Free dH2O至20 μl]；反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。real-time PCR根據說明書進行，總反應體系20 μl[包括SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μl，上游引物(10 μmol·L-1)0.8 μl，下游引物(10 μmol·L-1)0.8 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6 μl];反應條件為預變性95 ℃ 30 s 1個循環，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環，熔解反應95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。β-actin作為內參基因，數據分析采用2-ΔΔCt法。Gpc4引物序列(169 bp)：上游5′-AGAGCAACGCCCAACCAC-3′，下游5′-GCCA TTCCAGCAGTCATC-3′；Tbx15引物序列(128 bp)：上游5′-AGCTTCTGGAGACACCTGGATGA-3′，下游5′-CGTGGACTCGAGGCTGGTATTTA-3′；β-actin引物序列(171 bp)：上游5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCA AC-3′，下游5′-ATGGAGCCACCGATC CACA-3′。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 孕鼠攝食、產仔情況

結果見表1。

表1兩組孕鼠的平均攝食量及產仔情況

Tab1TheaveragefoodintakeandlitterincontrolandDEHPgroup

組 別nDEHP暴露劑量/(mg·kg-1·d-1)平均攝食量/g產仔總數/只對照組306.414DEHP組31206.515

經合籠后共有6只雌鼠懷孕，每組各3只，其余雌鼠棄用。DEHP組孕鼠喂飼含有質量分數為0.06% DEHP的基礎飼料，根據其平均攝食量6.5 g計算，其平均DEHP暴露劑量為120 mg·(kg·d)-1。由表1可見，對照組和DEHP組孕鼠產仔情況基本相同，兩組孕鼠的平均攝食量無明顯差異。

2.2 仔鼠體質量及脂肪分布情況

見表2。

表2兩組仔鼠出生9周后體質量、皮下脂肪及附睪脂肪質量

Tab2Thebodyweight，subtaneousandepididymaladiposetissuesweightofmice9weeksafterbirth

組 別n體質量/g皮下脂肪/g附睪脂肪/g對照組1418.01±2.060.05±0.010.20±0.04DEHP組1518.18±2.250.04±0.010.28±0.02a

與對照組相比,aP<0.05

由表2可見，兩組小鼠體質量和皮下脂肪質量差異無統計學意義(P>0.05)，DEHP組小鼠附睪脂肪組織質量顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 仔鼠附睪與皮下脂肪組織Gpc4 mRNA表達情況

兩組小鼠附睪脂肪Gpc4 mRNA表達均顯著高于皮下脂肪(P<0.05)，DEHP組小鼠附睪脂肪Gpc4 mRNA顯著高于對照組(P<0.01)，在皮下脂肪間無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

與對照組相比,aP<0.01;與皮下脂肪相比,bP<0.05

圖1仔鼠附睪與皮下脂肪組織Gpc4mRNA表達情況

Fig1TheexpressionofGpc4mRNAofepididymalandsubtaneousadiposetissuesinmice9weeksafterbirth

2.4 仔鼠附睪與皮下脂肪組織Tbx15 mRNA表達情況

與皮下脂肪相比,aP<0.01;與對照組相比,bP<0.01

圖2仔鼠附睪與皮下脂肪組織Tbx15mRNA表達情況

Fig2TheexpressionofTbx15mRNAofepididymalandsubtaneousadiposetissuesinmice9weeksafterbirth

由圖2可見，兩組小鼠皮下脂肪Tbx15 mRNA表達均顯著高于附睪脂肪(P<0.01)，DEHP組小鼠皮下脂肪Tbx15 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.01)，在附睪脂肪間無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

近年來，肥胖相關的慢性病已經成為危害人類健康的重要公共衛生問題，而脂肪蓄積部位的差異相比于肥胖本身更能影響慢性病的發病風險[7]。有報道鄰苯二甲酸酯作為一類環境內分泌干擾物可能會影響脂肪組織的分布，而DEHP作為鄰苯二甲酸酯中應用最廣泛的一種，受到更多的關注。據文獻報道，100 mg·kg-1·d-1劑量被認為低于可引起肝臟過氧化物酶體增殖的最低劑量[8]。本研究中孕鼠的DEHP暴露劑量為120 mg·kg-1·d-1，與文獻報道基本接近，結果顯示該暴露劑量不影響孕鼠的攝食量及產仔情況。

本研究結果顯示，兩組子代小鼠體質量雖然相同，但DEHP組小鼠附睪脂肪組織質量顯著高于對照組(P<0.05)，說明在胚胎期暴露于一定劑量的DEHP可導致仔鼠脂肪易于向內臟蓄積，影響脂肪組織的分布。DEHP通過何種機制影響脂肪組織的分布，目前還未見相關報道。有證據顯示，脂肪儲存的部位特異性是每個儲存部位脂肪細胞特性的內在差異[3]以及它們發育起源趨異的結果[4]。Gpc4是硫酸乙酰肝素糖蛋白中Gpc家族的成員，在控制細胞生長、分化和形態形成方面發揮關鍵作用。Tbx15是T-box轉錄因子家族成員，參與發育過程的調節。研究發現，這兩種胚胎發育及模式特異性基因與脂肪分布有關，內臟脂肪組織低水平的Tbx15表達及皮下脂肪組織低水平的Gpc4表達與高腰臀比(腹部肥胖)強烈相關；而皮下脂肪組織高水平的Tbx15表達及內臟脂肪組織高水平的Gpc4表達也與高腰臀比相聯系[6]。這提示內臟和皮下脂肪組織Tbx15與Gpc4的表達與脂肪分布有關。本研究發現，給予孕鼠DEHP后，其仔鼠附睪脂肪Gpc4 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.01)，而皮下脂肪Tbx15 mRNA表達也顯著高于對照組(P<0.01)，說明母鼠在孕期接觸低劑量DEHP可引起仔鼠內臟或皮下脂肪組織Gpc4和Tbx15表達改變，提示胚胎期低劑量DEHP暴露可能通過改變胚胎發育與模式特異性基因Gpc4和Tbx15的表達，影響脂肪組織的分布，使脂肪更傾向蓄積于內臟。

DEHP具體通過何種機制影響了Gpc4和Tbx15的表達，目前還不清楚。有研究發現，鄰苯二甲酸酯類可以誘導大鼠肝臟c-myc基因[9]以及雌激素受體α啟動子區[10]的低甲基化，改變其mRNA表達。因此，孕期DEHP暴露可能通過直接影響胚胎Tbx15的甲基化狀態而影響其mRNA表達。研究還發現，Gpc4啟動子活力高度依賴Sp3和Sp1的表達，在3T3-F442A細胞分化為脂肪細胞的過程中，Gpc4 mRNA的表達高低與Sp3蛋白、Sp3/Sp1的改變相一致，說明這兩種轉錄因子的表達可能是控制脂肪細胞Gpc4表達的決定因素[11]。因此，DEHP可能通過影響Sp3和(或)Sp1表達而改變Gpc4表達。

綜上所述，本研究結果提示胚胎期DEHP的暴露可能通過改變內臟及皮下Gpc4和Tbx15 mRNA的表達，影響脂肪組織的分布,其具體的調控機制還需進一步的探討。進一步的研究包括檢測Gpc4和Tbx15蛋白表達；建立仔鼠肥胖模型，觀察孕期接觸DEHP對子代肥胖發生情況及脂肪分布的影響；檢測Tbx15甲基化以及Sp3、Sp1表達情況等。

[1] MARTINELLI M I,MOCCHIUTTI N O,BERNAL C A.Effect of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) on lipolysis and lipoprotein lipase activities in adipose tissue of rats[J].Hum Exp Toxicol,2010,29(9):739-745．

[2] STAHLHUT R W,van WIJNGAARDEN E,DYE T D,et al.Concentrations of urinary phthalate metabolites are associated with increased waist circumference and insulin resistance in adult US males[J].Environ Health Perspect,2007,115(6):876-882．

[3] LAFONTAN M,GIRARD J.Impact of visceral adipose tissue on liver metabolism.Part I:heterogeneity of adipose tissue and functional properties of visceral adipose tissue[J].Diabetes Metab,2008,34(4 Pt1):317-327．

[4] BILLON N,MONTEIRO M C,DANI C.Developmental origin of adipocytes:new insights into a pending question[J].Biol Cell,2008,100(10):563-575．

[5] HATCH E E,NELSON J W,QURESHI M M,et al.Association of urinary phthalate metabolite concentrations with body mass index and waist circumference:a cross-sectional study of NHANES data,1999-2002[J].Environ Health,2008,7:27．

[6] GESTA S,BLUHER M,YAMAMOTO Y,et al.Evidence for a role of developmental genes in the origin of obesity and body fat distribution[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(17):6676-6681．

[7] 劉莉，劉亞莉，趙越，等.高脂飲食C57BL/6小鼠PAI-1表達及羅格列酮干預效果研究[J].現代醫學，2011,39(6)：653-657．

[8] FEIGE J N,GERBER A,GASALS-CASAS C,et al.The pollutant diethylhexyl phthalate regulates hepatic energy metabolism via species-specific PPARα-dependent mechanisms[J].Environ Health Perspect,2010,118(2):234-241．

[9] KOSTKA G,URBANEK-OLEJNIK K,WIADROWSKA B.Di-butyl phthalate-induced hypomethylation of the c-myc gene in rat liver[J].Toxicol Ind Health,2010,26(7):407-416．

[10] KANG S C,LEE B M.DNA methylation of estrogen receptor alpha gene by phthalates[J].J Toxicol Environ Health A,2005,68(23-24):1995-2003．

[11] LI H,MELFORD K,JUDSON A,et al.Murine glypican-4 gene structure and expression;Sp1 and Sp3 play a major role in glypican-4 expression in 3T3-F442A cells[J].Biochem Biophys Acta,2004,1679(2):141-155．