高血糖大鼠局部腦缺血再灌注損傷及拜阿司匹靈的干預(yù)作用

宋妮娜 高 政 孫文芳 趙 英 鄭瑞紅

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院，遼寧 大連 116031)

如何更好地預(yù)防腦血管病的發(fā)生、發(fā)展成為各國學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。腦缺血再灌注損傷及急性期伴發(fā)的高血糖狀態(tài)是近年來研究的重點(diǎn)問題。阿司匹林是神經(jīng)科常用藥，其在缺血性腦血管病的二級預(yù)防中已經(jīng)得到普遍認(rèn)可。本研究旨在通過預(yù)防性應(yīng)用拜阿司匹靈，觀察在高血糖狀態(tài)下，SD大鼠腦缺血再灌注后腦組織病理形態(tài)、神經(jīng)功能缺損情況以及抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1動物及分組 健康雄性SD大鼠36只，體重180～220 g，血糖正常，術(shù)前禁食12 h。隨機(jī)分為：對照組(n=18)、拜阿司匹靈組(n=18)，各組按缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分為三個(gè)亞組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1給藥方法 拜阿司匹靈研磨成粉末狀，生理鹽水稀釋溶解成混懸液。拜阿司匹靈組大鼠在手術(shù)前3 d灌胃，劑量為6 mg/kg。

1.2.2大鼠高血糖模型制備具體過程 栓線前血糖值>11.1 mmol/L表示模型建立成功。大鼠大腦中動脈(MCA)閉塞的腦缺血再灌注模型制備參照改良的 Longa-Zea線栓法〔1〕制作大鼠MCA梗阻再灌注模型。于栓塞90 min不再麻醉拔出栓線，分別于再灌注后3 h、6 h、24 h(每個(gè)亞組6只)處死動物。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1HE染色觀察 腦組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腦缺血損傷組織學(xué)特點(diǎn)、壞死性神經(jīng)元特征等。

1.3.2神經(jīng)功能缺陷評分 參照具體評分標(biāo)準(zhǔn)分別于再灌注后3 h、6 h、24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

1.3.3用SP免疫組織化學(xué)方法測定bcl-2的表達(dá) 每張切片在10×20倍顯微鏡下隨機(jī)選取缺血區(qū)內(nèi)的4個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)bcl-2免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 對照組：腦缺血區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)細(xì)胞皺縮，變性,且與周圍組織分界清楚,胞核固縮,組織間水腫明顯，可見空泡化改變，隨著再灌注時(shí)間延長，缺血神經(jīng)元損害加重，呈不可逆性神經(jīng)細(xì)胞損傷性改變,絕大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞壞死；拜阿司匹靈組與對照組相同再灌注時(shí)間點(diǎn)比較：變性、壞死的神經(jīng)元減少，空泡化改變減輕，組織間水腫減輕。見圖1。

2.2神經(jīng)功能缺損評分 在相同再灌注時(shí)間點(diǎn)，拜阿司匹靈組比對照組神經(jīng)功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。見表1。

圖1 兩組大鼠組織病理學(xué)觀察(HE,×200)

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

2.3免疫組化結(jié)果 胞質(zhì)有棕色顆粒者為bcl-2陽性細(xì)胞。在相同再灌注時(shí)間點(diǎn)，拜阿司匹靈組較對照組bcl-2陽性表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見表2，圖2。

表2 兩組再灌注各時(shí)間點(diǎn)bcl-2的表達(dá)

圖2 兩組大鼠組bcl-2表達(dá)(DAB,×200)

3 討 論

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，是腦缺血再灌注損傷后遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式。因此如果能阻止凋亡的發(fā)展，就有可能減輕腦缺血時(shí)腦損傷程度，縮小梗死范圍〔2〕。細(xì)胞凋亡時(shí)伴隨著一些凋亡促進(jìn)或抑制基因的表達(dá),這些基因通過對細(xì)胞凋亡發(fā)生過程的干預(yù)而對凋亡進(jìn)行調(diào)控。bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡基因的一種，是人體一個(gè)正?；?其蛋白表達(dá)產(chǎn)物定位于線粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),通過抵抗細(xì)胞凋亡而延長細(xì)胞壽命〔3〕。

神經(jīng)功能缺損評分，神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死可作為反映腦損傷程度的客觀指標(biāo)，因此可以通過觀察bcl-2的表達(dá)探討拜阿司匹靈在高血糖狀態(tài)下，減輕神經(jīng)功能缺損的分子機(jī)制，即在高血糖狀態(tài)下，拜阿司匹靈的神經(jīng)保護(hù)作用。

正常血糖水平，bcl-2的高表達(dá)能夠顯著提高腦缺血模型神經(jīng)元的存活率，能抑制凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用〔4〕。邱麗穎等〔5〕曾報(bào)道在正常血糖水平，6 mg/kg阿司匹林主要提高了bcl-2 基因蛋白的表達(dá),使bcl-2/ bax 比值升高。但是Lee等〔6〕通過建立大鼠大腦中動脈缺血模型發(fā)現(xiàn)，缺血2 h，再灌注24 h后，300 mg/kg阿司匹林并不能明顯影響腦梗死體積，抑制皮層半暗帶區(qū)腦組織的DNA片段及bcl-2的表達(dá)，因此認(rèn)為阿司匹林的抗凋亡作用并不顯著。阿司匹林對bcl-2的作用的不同觀點(diǎn)，可能與其劑量有關(guān)系，認(rèn)為在高血糖狀態(tài)下，小劑量的拜阿司匹靈能夠上調(diào)bcl-2的表達(dá)，起到抑制凋亡的作用，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的效果。

此外，高血糖能加重腦缺血損傷，機(jī)制包括：引起乳酸堆積發(fā)生酸中毒；影響內(nèi)皮細(xì)胞功能；引起興奮性氨基酸釋放，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載等〔7，8〕。高糖條件下，阿司匹林能促進(jìn)NO的釋放，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤、抗氧化損傷〔9，10〕。因此拜阿司匹靈可能通過減輕高糖所致的腦損害，從而減輕缺血再灌注損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

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