miR27a對結腸癌細胞增殖和侵襲能力的影響

何培生 唐 穎 周小平 芮曉云 周紅梅

(重慶三峽中心醫院普外二科，重慶 404000)

大量的研究證明miRNA參與腫瘤的發生發展、侵襲、治療和預后等過程，具有重要的生物學功能〔1～3〕。也有文獻〔4～6〕報道很多miRNA與結腸癌有關，如miR143和miR145等，但miR196a、miR146a、miR27a和miR200a等在結腸癌中的作用卻未見報道。本研究檢測miR196a、miR146a、miR27a和miR200a在結腸癌中的表達情況，并探討其中差異miRNA對結腸癌細胞增殖能力和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人結腸癌細胞株LoVo購自上海賽默生物科技發展有限公司。

1.1.2主要試劑 細胞培養用RPMI1640培養液、胎牛血清(FCS)、青霉素-鏈霉素(P-S雙抗)等均購自美國GIBCO公司，使用前按照89∶10∶1比例配制成完全1640培養液； mRNA抽提試劑盒miRNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司；cDNA逆轉錄試劑盒ReverAidTM First Strand Cdna Synthesis Kit購自Thermo公司；RT-PCR試劑盒FastvStart Universal SYBR Green Master Kit購自羅氏公司；轉染試劑脂質體lipofectamine2000(簡稱lipo2000)購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM I低血清培養基購自GIBCO公司；細胞計數試劑盒-8(CCK-8)購自碧云天生物技術研究所；miR27a mimics和miR27a inhibitors及陰性控制購自廣州銳博公司(RiBoBio)；Matrigel購自BD Bioscience公司；Transwell侵襲小室(8 pm孔徑)購自Millipore公司；細胞培養板購自美國Costar公司。

1.2方法

1.2.1病例樣本和體外實驗樣本量 正常組為33例健康志愿者的結腸組織，大腸炎組為26例結腸炎患者的炎性結腸組織，結腸癌組為42例結腸癌患者的結腸癌組織；體外實驗每組樣本量n≥6，每個實驗重復3次。

1.2.2RT-PCR 提RNA，逆轉錄為cDNA，取各組cDNA，用ddH2O稀釋50倍。設定以下循環：①50℃，2 min；②95℃，10 min；③95℃，15 s；④60℃，1 min；⑤重復第③④步；⑥95℃，15 s；⑦60℃，30 s；⑧95℃，15 s。上樣檢測。

1.2.3細胞培養 用含10％ FCS的L-15培養基培養。所有細胞均在37℃、無CO2、飽和濕度條件下傳代培養，選用對數生長期細胞進行實驗。

1.2.4細胞轉染實驗分組 (1)對照組，無任何轉染；(2)脂質體組，僅加入脂質體；(3)Negative組，加入無關序列和脂質體；(4)miR27a mimics轉染組，加入miR27a mimics 80 nmol/L(終濃度為100 nmol/L)和相應劑量的脂質體；(5) miR27a inhibitors轉染組，加入miR27a inhibitors 80 nmol/L(終濃度為80 nmol/L)和相應劑量的脂質體。

1.2.5轉染效率 轉染前24 h接種結腸癌細胞于24孔板，待生長至30％～50％匯合時，0pti-MEM I 釋轉染試劑lipo2000，另用Opti-MEM I 分別稀釋不同劑量的Transfection Control(Cy3)，使轉染時終濃度分別為40、60、80、100和120 nmol/L，室溫孵育5 min；二者混合，室溫培養20 min以形成Transfection Control(Cy3)-lipo2000混合物，再加入含有細胞及培養液的24孔板中，輕晃均勻；將培養板置于37℃、CO2培養箱中培養。24 h后用PCR檢測miR27a的表達情況，以確定最優轉染濃度。

1.2.6miR27a mimics和miR27a inhibitors轉染 轉染前24 h接種結腸癌細胞LoVo于6孔板，待生長至30％～50％匯合時，取Negative、miR27a mimics、miR27a inhibitors和脂質體，分別經Opti-MEM稀釋。于室溫中作用5 min后將兩者緩緩混合，靜置20 min，加入結腸癌細胞中搖晃混勻。培養6 h后換含10％胎牛血清的1640培養液，培養24～48 h后收集細胞用于后續實驗。另設單純脂質體轉染組，未轉染細胞做對照組。實驗重復3次。

1.2.7CCK-8檢測腫瘤細胞增殖能力 按照CCK-8試劑盒說明書進行。將結腸癌細胞LoVo按4×103個/孔接種于96孔培養板(100 μl/孔)中，待細胞貼壁后轉染。分別于轉染后(24、48、72 h)加入CCK-8 10 μl/L，37℃、5％ CO2培養2 h，酶標儀測定D450值。每個處理組設5個復孔。重復3次。

1.2.8侵襲能力檢測 結腸癌細胞體外侵襲實驗：用50 mg/L基質膠(BD公司)1∶4稀釋液包被8/μm孔徑Transwell小室濾膜的上表面，于37℃、5％CO2培養箱中溫育1 h，用L-15水化小室濾膜上、下表面。消化收集轉染后24 h的細胞，離心棄去培養液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1～2遍，用含0.1％BSA的L-15培養基重懸，調整細胞密度至1×105/ml的細胞懸液。24孔板中放置Transwell侵襲小室，先在小室上層分別加入事先制備好的4組細胞懸液200 μl，輕輕搖勻。再向下室加入600 μl含10％FBS的L-15培養液。置24孔板于37℃、無CO2培養箱中培養。48 h后從孔板中移出小室，用脫脂棉拭去小室濾膜上層未通過微孔的細胞，將此濾膜先于4％多聚甲醛中固定30 min，1％結晶紫染色10 min，使侵襲到濾膜下層的細胞充分著色呈紫藍色，輕輕洗滌殘余染料，倒置顯微鏡觀察，每組隨機選擇6個視野，計數。重復實驗3次。

1.3統計學方法 應用 SPSS17.0 軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1結腸癌癌組織中miR196a、miR146a、miR27a和miR200a的表達水平 與正常組相比，結腸炎組和結腸癌組中miR196a的表達基本沒有變化；正常組和結腸炎組miR146a的表達也沒有差異，而結腸癌組miR146a的表達水平則比正常組略有增高，但是并沒有統計學意義(P>0.05)；同樣，結腸炎組中miR27a的表達與正常組一致，但結腸癌組miR27a的表達水平與正常組和大腸炎組相比顯著增加(P<0.05)；miR200a在結腸炎組和結腸癌組中的表達水平比正常組均略有增高，但仍沒有統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 結腸癌癌組織中miR196a、miR146a、miR27a和miR200a的表達水平

2.2轉染效率 miR27a mimics轉染組隨著轉染劑量的不斷增加，檢測到的胞內miR27a水平也逐漸增多，終濃度為80 nmol/L時，miR27a的水平達到高峰，之后終濃度增至100和120 nmol/L時，miR27a的水平則進入平臺期，不再增加(圖2A)；miR27a inhibitors轉染組隨轉染劑量的增加，胞內miR27a水平逐漸下降，當終濃度為100 nmol/L時，miR27a inhibitors的水平降至最低，濃度增加為120 nmol/L時，miR27a inhibitors的水平并無明顯下降，進入平臺期(圖2B)。故選擇100 nmol/L終濃度作為miR27a mimics和miR27a inhibitors的最優轉染濃度。

2.3miR27a對結腸癌細胞增殖能力的影響 對照組、脂質體組和Negative組結腸癌細胞的增殖曲線基本相似，增殖速度無明顯差異，而miR27a mimics組與Negative組相比結腸癌細胞的增殖速度顯著升高(P<0.05)，且miR27a inhibitors組結腸癌細胞的增殖速度比Negative組明顯下降(P<0.05)。見圖3。

圖2 結腸癌細胞轉染miR27a mimics和miR27a inhibitors后的表達水平

圖3 miR27a對結腸癌細胞增殖能力的影響

2.4miR27a對結腸癌細胞侵襲能力的影響 對照組細胞具有一定的侵襲能力，48 h穿過8 μm孔徑的細胞數為(30±6)個，脂質體組和Negative組侵襲能力與對照組一致，穿過8 μm孔徑的細胞數分別為(28±5)和(28±9)個。而miR27a mimics轉染組穿過8 μm孔徑的細胞數〔(51±10)個〕比Negative組的侵襲能力顯著增加(P<0.05)；而與Negative組相比，miR27a inhibitors轉染組的侵襲能力明顯下降，其48 h穿過8 μm孔徑的細胞數為(15±4)個(P<0.05)。

3 討 論

結腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，它的發生與多種因素有關，如糖尿病、炎性腸病和吸煙等〔7〕。已有文獻報道miR196a、miR146a、miR27a和miR200a等在胰腺癌和卵巢癌等嚴重疾病中均出現表達差異，且發揮了十分重要的作用〔8～10〕。

本研究結果提示miR196 m、miR146a、miR27a、miR200a對癌細胞的功能如增殖能力和侵襲能力等都可能有顯著影響。另外隨著轉染劑量的增加，miR27a mimics和miR27a inhibitors對miR27a的調控作用越明顯，綜合考慮，選100 nmol/L作為轉染的優化濃度，而且miR27a能增強結腸癌細胞的增殖能力。除增殖能力之外，腫瘤細胞的侵襲能力也是反映其惡性程度的一項重要指標，miR27a能增強結腸癌細胞的侵襲能力。

綜上，結腸癌患者的結腸癌細胞中，miR27a的表達顯著上調，而miR27a的上調則能增強結腸癌細胞的增殖能力和侵襲能力，從而促進結腸癌的進一步發展和惡化。本研究彌補了這些miRNA在結腸癌研究中的不足，也為進一步深入研究結腸癌的發生發展機制提供了一種新的可能性。

4 參考文獻

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