喉癌組織中腫瘤出芽與血管內皮生長因子-C表達及淋巴結轉移的關系

高立生 高 珊 霍 峰 宋有鑫 齊志偉 畢 靜 徐 勤

(承德護理職業學院,河北 承德 067000)

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，主要病理類型為鱗狀細胞癌，其發病率逐年上升，腫瘤侵襲性癌細胞淋巴結轉移成為影響其預后的主要原因。腫瘤出芽是腫瘤侵襲性判斷的重要特征，可作為腫瘤發展的預判指標〔1〕。血管內皮生長因子(VEGF)-C是目前發現的唯一可調節胚胎組織淋巴管生成的因子，是最具特異性的淋巴管內皮生長刺激因子。本文檢測喉鱗癌組織中腫瘤出芽、VEGF-C表達及其與微淋巴管生成、淋巴結轉移的關系，探尋能夠快速準確預判喉癌發生發展過程中淋巴結轉移的有效方法。

1 資料與方法

1.1材料 60例喉癌組織取自2006年6月至2011年12月于承德醫學院附屬醫院耳鼻咽喉科住院手術60例原發喉鱗癌患者。術前均未接受放、化療，標本為手術切除后1 h內獲得，標本獲得后經10％甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚度連續切片。所有標本均經過病理學檢查確診。其中男52例，女8例；年齡42～74歲，中位年齡60歲，<60歲33例，≥60歲27例；采用2010年國際抗癌協會(UICC)公布的TNM分期標準，Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ、Ⅳ期24例；有淋巴結轉移的22例，無淋巴結轉移的38例(有無淋巴結轉移根據術后病理而定)；聲門上型30例，聲門型30例；發病前吸煙史20年以上(>20支/d)者48例為吸煙組，余12例為對照組；癌腫<3 cm者40例，癌腫≥3 cm者20例；高分化(G1級)35例，中低分化(G2級～G3級)25例。

1.2試劑和儀器耗材 兔抗人VEGF-C多克隆抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3實驗方法 腫瘤出芽采用組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色后鏡下判斷，判斷標準：在腫瘤浸潤前沿可見孤立單個的癌細胞或5個以下癌細胞組成的小癌細胞群，即判斷腫瘤出芽，否則即判斷無腫瘤出芽〔2〕。免疫組織化學SP法，相應每例標本解凍后經甲醛固定24 h 內行石蠟包埋,連續切取切片3張,分別進行VEGF-C和D2-40染色石蠟切片(5 μm)，常規脫蠟至水，3％過氧化氫室溫孵育10 min，抗原修復15 min，室溫放置40 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，小牛血清封閉10 min，滴加一抗 (1∶100工作液)4℃過夜，PBS沖洗，加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色5 min，終止顯色，蒸餾水沖洗，HE復染，透明，封片，鏡檢。

1.4結果判定 VEGF-C主要表達于細胞質或細胞核(多數在胞質)，以出現棕黃色顆粒為陽性反應。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知喉癌陽性組織切片為陽性對照。采用Volm雙評分法進行判定在染色均勻的腫瘤區，選取5個高倍鏡視野(×200):①按染色陽性細胞百分率(A值)評分：陰性為0分，<25％為1分，25％～50％為2分，>50％為3分；②按染色強度(B值)評分：不著色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合A值與B值判斷結果，陰性：0分，陽性：1～6分。以上結果的判定均由兩位不知患者臨床病理資料的病理科醫師進行。

2 結 果

2.1腫瘤出芽、VEGF-C蛋白在喉癌組織的表達 在60例喉癌組織標本中，HE染色觀察腫瘤出芽為喉癌組織浸潤前沿見到孤立單個的癌細胞或5個以下癌細胞組成的小癌細胞群，出芽的癌細胞呈梭型或多邊形，細胞核深染具有異型性，胞質豐富且呈嗜酸性。60例喉癌組織標本中腫瘤出芽檢出率58.33％，其中22例淋巴結轉移患者中腫瘤出芽20例，檢出率靈敏度90.91％。免疫組化切片中，VEGF-C陽性表達率為68.33％，且主要分布于腫瘤浸潤邊緣。喉癌組織中腫瘤出芽與VEGF-C二者呈顯著正相關(P<0.05)。其中VEGF-C陽性時，腫瘤出芽陽性30例，陰性11例；VEGF-C陰性時，腫瘤出芽陽性5例，陰性14例。腫瘤出芽及VEGF-C表達符合率73.33％。見圖1。

A

B

2.2腫瘤出芽、VEGF-C蛋白表達與喉癌臨床病理因素間的關系 喉癌組織中腫瘤出芽與淋巴結轉移有相關性(P<0.05)，與臨床分期、分化程度、腫瘤大小、吸煙量、年齡及性別無相關性(均P>0.05)；VEGF-C表達與喉癌患者淋巴結轉移、臨床分期、分化程度密切相關(均P<0.05)，與喉癌患者腫瘤大小、吸煙量、年齡及性別無相關性(均P>0.05)。見表1。

表1 喉癌組織中腫瘤出芽、VEGF-C表達與臨床病理因素的關系〔n(％)〕

3 討 論

腫瘤出芽為實質性腫瘤組織浸潤前沿見到孤立單個的癌細胞或5個以下癌細胞組成的小灶性癌細胞群，出芽的癌細胞呈梭型或不規則形，細胞核深染且具有明顯的異型性，胞質豐富且呈嗜酸性〔3〕。研究人員近年來通過對宮頸癌、口腔鱗癌及胃癌組織檢測，認為有腫瘤出芽的實質性腫瘤，即使該患者淋巴結轉移陰性，仍具有很高的侵襲性及轉移風險，提出了腫瘤出芽可以作為判斷實質性腫瘤淋巴結轉移的獨立預測指標的推論〔4,5〕。

VEGF-C被認為是目前已知最具特異性的淋巴管內皮生長刺激因子，高表達可促進淋巴管增生及淋巴道轉移〔6〕。VEGF-C具有高度特異性的血管內皮分裂原，可誘導血管新生病增加新生血管的通透性。VEGF-C可能通過促進淋巴管形成并增生，從而增加淋巴管與腫瘤細胞接觸面積使之利于出現轉移，同時通過淋巴管數目的增加及接觸面積的加大產生擠壓現象使淋巴管通透性和腫瘤間質間的壓力增加，新生淋巴管與原有淋巴管增生擴張融合，形成淋巴管網，更利于腫瘤細胞進入淋巴管及靜脈血管〔7〕。VEGF-C在增強腫瘤和周圍組織親和力的同時，還扮演著趨化因子的角色，促進癌細胞向淋巴管方向移動〔8〕，另外研究發現，腫瘤細胞自身產生大量的VEGF-C，與自身的受體(VEGFR)-3結合，使之磷酸化，促進淋巴管內皮生成并使腫瘤細胞通過新生淋巴管轉移至相應區域，引起腫瘤高轉移率〔9〕。而VEGF-C還可以通過降低癌細胞與胞外基質黏附性，使之易脫落“游走”，促進其侵襲性〔10〕。Wiericnkx等〔11〕研究發現腫瘤邊緣區LMVD增加與淋巴結轉移密切相關。Kimura等〔12〕發現食管鱗癌患者術前血清VEGF-C水平明顯高于健康人，且術后復發者血清VEGF-C水平顯著高于無復發者，認為術前VEGF-C高水平含量是腫瘤復發獨立危險因素。Tes等〔13〕在喉鱗癌組織中通過免疫組化檢測到VEGF-C高表達，且VEGF-C與喉鱗癌組織的淋巴結轉移、臨床分期、分化程度密切相關。本實驗結果推測，腫瘤出芽可能通過提高癌細胞外基質代謝，使癌周環境改變難以繼續生長，降低細胞間質黏附性，促使癌細胞向外周侵襲轉移尋找生長空間；腫瘤出芽可能還通過釋放VEGF-C促進前沿區域微淋巴管形成，制造轉侵襲移的“通道”，所以腫瘤出芽的出現可以看成喉癌細胞侵襲轉移的前奏。同時，VEGF-C通過表達增高刺激周圍淋巴管內皮細胞數目和面積增生，從而擠壓遷移促進癌組織中腫瘤微淋巴管大量生成及腫瘤淋巴道轉移。提示在喉癌發生發展過程中腫瘤出芽和VEGF-C協同發揮了重要作用機制，這與Vered 等〔14〕的研究結論大概一致。

本實驗提示腫瘤出芽和VEGF-C可作為喉癌轉移及負向預后的預判標準。如能通過某種途徑抑制腫瘤出芽和VEGF-C過度表達，可減少癌細胞通過淋巴道轉移的概率，對于喉鱗癌治療將有主要意義。

4 參考文獻

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