結締組織生長因子在糖尿病大鼠腎臟損傷中的作用及絲膠的干預效果

楊振軍 劉東慧 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北 承德 067000)

結締組織生長因子(CTGF)是與促進纖維化和細胞外基質(ECM)沉積密切相關的細胞因子，可通過促進ECM沉積在腎小管間質纖維化、腎小球硬化等方面發(fā)揮重要作用〔1〕。人體的多種組織器官，如心血管系統(tǒng)、腦、肝臟、骨骼肌、消化道、腎臟和胰腺等均發(fā)現(xiàn)有CTGF存在，其中腎臟的含量最高，但在生理情況下CTGF的表達水平很低〔2〕。目前，治療糖尿病多采用控制飲食、運動、口服降糖藥物、注射胰島素等方法，但上述方法均有其治療的局限性，并且均不能有效改善胰島素抵抗及保護胰島細胞〔3,4〕。根據(jù)民間蠶繭泡水輔助降糖的用法，本課題組進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)絲膠可有效降低血糖、改善糖尿病時血脂代謝紊亂及保護糖尿病時生殖功能障礙〔5,6〕。

1 材料與方法

1.1動物、分組及處理 48只清潔級健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：712024。隨機選取其中的12只作為正常對照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量鏈脲佐菌素(STZ)溶劑3次(1次/d)；其余的36只大鼠按25 mg/kg的劑量連續(xù)3 d腹腔注射2％的STZ，成模標準是注射STZ 1 w后空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L〔7〕。成功建立2型糖尿病模型的大鼠隨機分為糖尿病模型組、絲膠治療組和陽性對照組，每組12只，絲膠治療組大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的劑量灌胃給予絲膠35 d，陽性對照組大鼠灌胃給予二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)35 d，正常對照組、模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水35 d。

1.2藥物和試劑 絲膠(承德醫(yī)學院蠶業(yè)研究所)：浸泡后水煎2次，合并濾液并濃縮。STZ美國Sigma公司，用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)配制；血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司；纖維連接蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗CTGF多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；辣根酶標記的山羊抗兔IgG(二抗)，美國KPL公司；BCA蛋白定量試劑盒、藍色預染蛋白質Marker、蛋白裂解液、1 200 bp DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；β-actin單克隆抗體，美國Santa公司；Trizol，美國Invitrogen公司；CTGF、β-actin引物，上海生工公司；PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.3檢測血液指標 4％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經內眥取血，3 000 r/min離心20 min后收集血清，-20℃冰箱保存。葡萄糖氧化酶法檢測血糖，ELISA法檢測纖維連接蛋白含量。

1.4大鼠腎臟CTGF表達的檢測 大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.4.1Western 印跡法檢測CTGF蛋白的表達 取液氮保存腎臟提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。每個上樣孔加80 μg總蛋白行12％ SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜；5％脫脂奶粉37℃封閉1 h，加一抗(β-actin 1∶1 000、CTGF 1∶100)于4℃過夜；洗膜后加入辣根酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫搖床孵育1 h，洗膜后加入Super ECL Plus超敏發(fā)光液，曝光后掃描。以β-actin為內參照，采用Quantity One-v 4.6.2軟件對Western條帶進行定量分析，以目的蛋白條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為CTGF蛋白的相對表達水平。

1.4.2RT-PCR法檢測CTGF mRNA的表達 取液氮保存腎臟，按Trizol試劑說明提取腎臟總RNA，并反轉錄成cDNA，產物進行PCR。PCR引物序列：CTGF正義鏈:5’- CCTACCGACTGGAAGACACATT-3’，反義鏈:5’-GATGCACTTTTTGCCCTTCTTA-3’，退火溫度56℃，循環(huán)次數(shù)：30次，產物大小230 bp；β-actin正義鏈:5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反義鏈:5’-CTGGAAGGTGGACAGTGAG’-3，退火溫度55℃，循環(huán)次數(shù)：29次；產物大小445 bp。PCR反應體系50 μl，取5 μl擴增產物及5 μl DNA Ladder行2％瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析儀攝像，應用Quantity One-v 4.6.2軟件進行分析，以目的條帶和β-actin條帶吸光度的比值，作為CTGF mRNA的相對表達水平。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠腎臟CTGF的表達 模型組大鼠腎臟CTGF蛋白及mRNA的表達較正常對照組大鼠高(P<0.01)；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟CTGF的表達，絲膠治療組、陽性對照組大鼠腎臟CTGF蛋白及mRNA的表達明顯較模型組大鼠低(P<0.01，P<0.05)。見圖1，圖2、表1。

圖1 大鼠腎臟CTGF mRNA的表達

2.2各組大鼠的血糖和血清纖維連接蛋白的含量 與正常對照組比較，模型組大鼠的血糖、纖維連接蛋白的含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，絲膠治療組、陽性對照組大鼠的血糖和纖維連接蛋白的含量明顯降低(P<0.01)。見表1。

1.正常對照組，2.模型組，3.絲膠治療組，4.陽性對照組,下圖同

與模型組比較：1) P<0.01,2) P<0.05

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，3～5個月的糖尿病大鼠，腎小球和整個腎皮質CTGF mRNA的表達均明顯增加〔8〕；本研究也證實了這一點，糖尿病模型大鼠腎臟CTGF蛋白和mRNA的表達水平明顯升高。糖尿病時，高血糖、晚期糖基化終末產物、血管緊張素Ⅱ、5-羥色胺等均可導致腎臟CTGF表達水平的升高〔9,10〕。CTGF表達上調后，一方面通過抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性打破MMPs/TIMPs的平衡，使ECM合成和降解的平衡失調，從而引發(fā)腎間質纖維化〔11,12〕；另一方面，CTGF可在許多方面介導TGF-β1的致腎臟纖維化作用〔13〕。CTGF作為介導TGF-β1致纖維化的因子，可通過促進細胞有絲分裂和TGF-β1的作用，使ECM成分合成增加、降解減少，進而導致腎臟肥大、腎小球硬化以及腎小管纖維化〔14〕。研究資料顯示，應用轉化生長因子(TGF)-β1和CTGF刺激細胞能加速ECM合成，而降低TGF-β1和CTGF的表達，可通過減少ECM合成保護腎臟損傷〔15,16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠血清ECM成分纖維連接蛋白的含量，降低糖尿病模型大鼠腎臟CTGF的表達。本研究表明，絲膠可通過下調CTGF的表達，一方面恢復糖尿病時腎臟MMPs/TIMPs的平衡狀態(tài)，另一方面拮抗CTGF介導的TGF-β1的致腎臟纖維化的作用；因此，絲膠可通過減少ECM的合成恢復ECM合成和降解的平衡，延緩腎小球硬化和腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮對糖尿病腎臟損傷的保護作用。本研究為進一步開發(fā)利用蠶繭治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了可靠的實驗資料。由于絲膠是天然的蛋白質，可避免化學合成藥物帶來的毒副作用，值得進一步探討絲膠治療糖尿病及其并發(fā)癥的相關作用及機制。

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