EGFR抑制劑對裸鼠鱗狀食管癌的抑制作用

許雙塔 許建華 鄭正榮 趙清泉 姚方輝 賀雅莉

(福建醫科大學附屬第二醫院腫瘤科，福建 泉州 362000)

表皮生長因子受體(EGFR)是一類將細胞外信號轉導到細胞內的重要途徑蛋白受體，具有酪氨酸激酶(TK)的活性。研究證實〔1〕，多數實體瘤，如鱗狀食管癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌、喉癌等都存在EGFR蛋白過度表達。現在研究的分子靶向藥尤其是抗腫瘤靶向藥物主要分為兩類〔2〕，OSI-774、IMC-C225均屬于EGRF-TK拮抗劑，在頭頸部腫瘤中顯示出良好的抑制作用〔3〕，但未見對食管癌的研究。本文通過建立鱗狀食管癌裸鼠荷瘤模型，研究EGFR抑制劑OSI-774、IMC-C225單藥以及聯合治療抗腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雌性裸鼠40只，購自北京利華公司，10～12周齡，體質量20～24 g；鱗狀食管癌細胞株(中科院上海生物研究所)；OSI-774(埃羅替尼，羅氏制藥)；IMC-C225(西妥昔單抗注射液，德國霍克大藥廠)。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型建立 將鱗狀食管癌細胞株懸浮于RPMI-1460(含10%FBS)培養液中，于5%CO2飽和，37℃下傳代培養，維持細胞單層生長；收集腫瘤細胞與RPMI制成1∶1的細胞懸浮液，細胞密度為1×108個/ml。用1 ml注射液吸取0.2 ml腫瘤細胞注射在裸鼠皮下，觀察1 w，至腫瘤直徑>1 cm，進行藥物治療。

1.2.2分組及給藥 將40只裸鼠按照隨機數字表分為4組，對照組：不進行任何治療；OSI-774組予OSI-774 30 mg/kg，灌胃給藥， 1次/d；IMC-C225組予IMC-C225 50 mg/kg，靜脈給藥，1次/d；OSI-774聯合IMC-C225組(OSI-774、IMC-C225劑量、用藥方法同以上兩組)。治療過程中觀察裸鼠的體重及生存狀態。

1.3觀察指標

1.3.1腫瘤體積變化 治療后第3天開始測量并記錄腫瘤體積，以卡尺測量腫瘤最大垂直徑(L)與最短直徑(D)，計算公式〔4〕：腫瘤體積(V)=(L+D2)/2 mm3，記錄腫瘤體積及生長時間，直至腫瘤體積達到3 cm3時，對比生長時間。

1.3.2免疫熒光染色法檢測腫瘤組織 治療1 w后，隨機選取4只裸鼠模型，切除完整腫瘤組織，5%甲醛固定，石蠟包埋，用熒光標記的caspase、Ki67標記，熒光顯微鏡下觀察caspase、Ki67的表達。

1.3.3細胞增殖測定 利用熒光染色檢測Ki67陽性腫瘤細胞計數(1 000個腫瘤細胞中Ki67陽性腫瘤細胞數)，計算Ki67指數，從而檢測腫瘤細胞增殖狀態。

1.3.4腫瘤細胞凋亡檢測 利用熒光染色的caspase檢測細胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下選擇caspase陽性細胞分布較均勻的4個區域，計算陽性細胞數，取平均值。

2 結 果

2.1腫瘤細胞生長時間評價 建立的鱗狀食管癌裸鼠荷瘤模型在1 w后均正常存活，可以觸及腫瘤硬塊，平均直徑>1 cm。治療后發現，聯合組達到30 m2的時間較其他組明顯延長。見表1，圖1。

2.2腫瘤細胞增殖評價 對照組Ki67指數最高，熒光染色顯示Ki67高表達，提示細胞增殖速度快，生長活躍；OSI-774組、IMC-C225組Ki67相對表達少，細胞增殖受到抑制；OSI774聯合IMC-C225組Ki67較前3組下降明顯，說明細胞增殖受到明顯抑制，見表1。

2.3腫瘤細胞凋亡評價 OSI-774組(5.7±0.4)、IMC-C225組(5.8±0.1)較對照組(3.6±0.2)細胞凋亡明顯增加(P=0.022，0.002)，OSI-774聯合IMC-C225組(10.9±0.7)較前3組凋亡明顯(P=0.006，0.009，0.005)，提示聯合組可以起到協同治療的作用。

表1 4組試驗中各項指標對比±s,n=10)

圖1 4組治療后腫瘤體積隨時間的變化

3 討 論

EGFR基因位于人類7號染色體的短臂上，含有28個外顯子，長度為118 kb，有1 210個氨基酸編碼的糖蛋白(分子量為170 kD)〔5〕。目前發現EGFR突變與多種腫瘤發生有關，主要突變形式為基因點突變、基因擴增、基因插入和基因缺失〔6〕。大量文獻提示〔7〕EGFR突變集中于18～22外顯子，主要位于EGFR-TK區，其中19外顯子多為缺失，占所有突變的47%；21外顯子多為基因替代，占所有突變的45%。因此普遍認為這兩處突變可以增強腫瘤細胞對酪氨酸激酶抑制劑的敏感性，并且是EGFR抑制劑治療的有效預測指標。Paez等〔8〕利用DHPLC檢測了100多種肺癌組織，發現了28例突變，其中包含19外顯子的缺失和21、22外顯子的替代。Mukasa等〔9〕檢測70例胰腺癌組織，發現只有2例有20外顯子突變，但是卻有29例基因擴增，高達41.4%。Noh等〔10〕的一項報告中發現，在59例卵巢癌檢測18～22外顯子突變情況，發現3例突變，且均為19外顯子缺失。

抗腫瘤靶向藥物主要分為2類，一類為酪氨酸激酶的抑制劑，主要通過抑制EGRF-TK中酪氨酸激酶的活性來抑制腫瘤的生長；另一類是通過阻斷EGRF-配體復合物的形成阻斷信號傳遞，抑制腫瘤生長。其中，OSI-774、IMC-C225均屬于EGRF-TK拮抗劑。臨床上使用IMC-C225治療直腸癌取得了良好的效果〔11〕，證實了IMC-C225可以逆轉放化療的抗性，提高患者的生活質量和生存期，且不良反應較低。也有研究證實〔12〕OSI-774聯合化療可以提高頭頸部腫瘤患者的局部控制率，減少復發，延長生存期。綜合國內外研究報道〔13〕，發現EGFR抑制劑在非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌、結直腸癌治療上均取得了巨大的進展，但是同樣的藥物和方法是否可以應用于其他腫瘤治療尚需要進一步驗證。本研究結果說明OSI-774和IMC-C225聯合可以增進療效。為臨床藥物治療及分子靶向藥物研究提供一定參考。

4 參考文獻

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