白藜蘆醇對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用及機制

李春花 周 磊

(吉林省人民醫院內分泌科，吉林 長春 130021)

糖尿病腎病(DN)已經超過高血壓腎病成為我國終末期腎病的第二位病因〔1〕。目前現有的臨床治療方法難以完全阻斷DN進展，因此迫切需要深入研究其機制以開發新的治療方法。白藜蘆醇是一種從植物中提取的多酚醇類物質，是沉默信息調節子(SIRT)1的天然激活劑。現有大量研究證明，其對糖尿病的多種并發癥具有良好的治療作用，但機制尚不完全清楚〔2〕。SIRT1作為三級組蛋白去乙酰化酶，其活性變化可影響線粒體代謝和功能〔3〕。本研究觀察白藜蘆醇干預后DN大鼠腎組織中線粒體分裂、融合基因轉錄水平變化和線粒體膜電勢變化，探討其對腎臟的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠45只，體重(200±20)g。隨機分為對照組、DN組和白藜蘆醇治療組(RSV組)各15只。

1.2試劑與儀器 RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，PCR試劑盒購自北京天根公司，白藜蘆醇購自美國Sigma公司，組織線粒體提取試劑盒購自美國Thermo公司，線粒體膜電勢檢測試劑盒JC-1購自上海碧云天生物技術有限公司，全自動生化分析儀為日本Olympus公司產品。

1.3建立DN大鼠模型 參考文獻〔4〕進行少量修改，建立2型DN大鼠模型。健康Wistar大鼠，高脂飲食，腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg建立2型糖尿病模型(空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖++以上)，繼續喂養12 w，根據血尿生化學檢測、組織形態學檢測，確立DN大鼠模型建立成功。

1.4給藥方法 對照組和DN組生理鹽水5 ml·kg-1·d-1灌胃。RSV組白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1灌胃。均連續給藥12 w，于治療結束后，收集24 h尿標本，腹腔麻醉，取血標本和腎組織標本。

1.5檢測指標 生化分析法檢測血糖，酶聯免疫法測定24 h尿白蛋白排泄率，肌酐清除率。

1.6線粒體分裂、融合基因轉錄水平表達變化 提取大鼠腎組織總RNA，分光光度計測定RNA質量和濃度。實時多聚酶鏈反應(RT-PCR)法檢測線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和線粒體分裂基因Fis1、Drp1 mRNA表達變化。引物及PCR反應條件見參考文獻〔5〕。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，天能凝膠成像系統成像保存。

1.7線粒體膜電勢檢測 按照線粒體提取試劑盒說明書，從新鮮腎組織中提取完整線粒體，用線粒體膜電勢檢測試劑盒(JC-1)染色線粒體，流式細胞儀最大激發波長為514 nm，最大發射波長為529 nm檢測。

1.8統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組空腹血糖的比較 對照組空腹血糖(5.13±0.62)mmol/L，DN組(24.55±2.16)mmol/L,RSV組(21.74±5.34)mmol/L。DN組和RSV組血糖無明顯差異(P>0.05)。

2.2各組肌酐清除率和24 h尿白蛋白的比較 對照組肌酐清除率(0.13±0.02)ml·min-1·100 g-1，DN組(0.37±0.07)ml·min-1·100 g-1，RSV組(0.19±0.05)ml·min-1·100 g-1。與DN組相比，RSV組明顯降低(P<0.05)。對照組24 h尿白蛋白(1.93±0.42)mg/24 h，DN組(15.12±3.47)mg/24 h，RSV組(7.04±2.32)mg/24 h。與DN組相比，RSV組明顯降低(P<0.05)。

2.3各組腎臟組織中線粒體動態變化平衡的影響 與對照組相比，線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和線粒體分裂基因Fis1、Drp1在DN組均有不同程度增高，但其中Mfn2表達變化不明顯。與DN組相比，RSV組Mfn1、Fis1降低明顯(P<0.05)，而Drp1雖有所降低，但程度變化較小(見表1和圖1)。

表1 3組Mfn1、Mfn2、Fis1、Drp1mRNA表達的密度掃描(n=3,±s)

圖1 各組Mfn1、Mfn2、Fis1和Drp1的RT-PCR結果

2.4各組腎臟組織中線粒體膜電勢的影響 與對照組(100.0%)相比，DN組、RSV組線粒體膜電勢均有降低(P<0.05)。與DN組(60.24%±7.11%)相比，RSV組(83.04%±9.17%)明顯增高(P<0.05)。

3 討 論

糖尿病是慢性代謝性疾病，其發病率在全世界范圍內呈持續增長勢頭。糖尿病患者長期的高血糖狀態是促進血管病變和功能障礙的根本因素，引起多種糖尿病并發癥，是糖尿病患者主要的致殘致死原因。老年患者是慢性代謝性疾病和心血管疾病的高發人群。在臨床治療中，血糖穩態控制的困難及腎素-血管緊張素系統抑制劑治療難以完全阻斷腎病進展。SIRT1作為代謝相關疾病治療研究的熱點，其在腎臟活化可能成為新的治療靶點，以抵抗多種因素導致的腎臟疾病包括DN的發生發展〔3〕。本文結果表明白藜蘆醇具有明顯的腎臟保護作用。

細胞內SIRT1活性受代謝和環境因素的影響。熱量限制、饑餓、氧化應激和DNA損傷等都可誘導SIRT1表達增加，而高脂飲食、胰島素抵抗、高血糖、老化則引起SIRT1表達降低。SIRT1去乙酰化底物是細胞代謝、能量消耗、炎癥和應激反應通路的中心調節因子〔6〕。如SIRT1可通過去乙酰化賴氨酸殘基激活過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(PGC)1α，增高線粒體生物能量合成〔7〕。葡萄糖是維持煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型/還原型(NAD+/NADH)穩態的關鍵代謝底物，高血糖會通過影響重要代謝途徑降低胞質NAD+/NADH比率，從而影響SIRT1活性。綜上所述，高血糖狀態可影響SIRT1活性和線粒體功能，而SIRT1、線粒體功能均在糖尿病及其并發癥的發病機制中具有重要作用。

線粒體的動態變化包括線粒體分裂過程和線粒體融合過程。線粒體分裂、融合過程的平衡對于維持線粒體正常的形態、分布和功能十分重要〔8〕。本文表明線粒體的動態平衡在DN過程中發生變化。白藜蘆醇能明顯提高DN大鼠腎組織線粒體功能。白藜蘆醇可通過活化SIRT1從而影響線粒體動態平衡和功能發揮對DN大鼠腎臟功能的保護作用。

4 參考文獻

1侯振江，牟兆新，周秀艷，等. 尿微量白蛋白在糖尿病和高血壓腎病早期診斷中的應用〔J〕. 中國實驗診斷學,2010;14(9): 1389-92.

2Kume S,Thomas MC，Koya D.Nutrient sensing,autophagy,and diabetic nephropathy〔J〕. Diabetes,2012;61(1):23-9.

3Kitada M,Kume S,Takeda-Watanabe A,etal.Sirtuins and renal diseases: relationship with aging and diabetic nephropathy〔J〕.Clin Sci (Lond),2013;124(3):153-64.

4傅松波,湯旭磊,賈麗云,等.苦參堿對糖尿病大鼠腎臟的保護作用〔J〕.中國老年學雜志,2010;30(3):376-8.

5Jendrach M,Mai S,Pohl S,etal. Short and long-term alterations of mitochondrial morphology,dynamics and mtDNA after transient oxidative stress〔J〕. Mitochondrion,2008;8: 293-304.

6Moscat J,Diaz-Meco MT.Feedback on fat: p62-mTORC1-autophagy connections〔J〕. Cell,2011;147(4): 724-7.

7Nakahira K,Haspel JA,Rathinam VA,etal.Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome〔J〕. Nat Immunol,2011;12(3): 222-30.

8Lavu S,Boss O,Elliott PJ,etal.Sirtuins-novel therapeutic targets to treat age-associated diseases〔J〕. Nat Rev Drug Discov,2008;7(10): 841-3.