齊墩果酸對快速老化小鼠海馬神經元及APP/PS1基因表達的影響

張琳琳 張素玲 張玉蓮 王 凱 王雪研

(天津中醫藥大學第二附屬醫院腦病科，天津 300150)

阿爾茨海默病(AD) 是一種進行性的以認知功能障礙、記憶能力下降為特點的神經變性病，主要臨床特征是患者出現智力、記憶力、感覺定向不可逆退化，其特征性的病理改變主要有老年斑(SP)、神經元纖維纏結(NFT)、神經元大量丟失〔1〕。從中醫角度來講，AD是由于“腎精虧虛”、“髓海不足”引起的〔2〕，因此用補腎中藥防治AD有重要的作用。故本研究擬觀察補腎中藥女貞子的有效成分齊墩果酸對快速老化小鼠(SAMP8)海馬神經元及APP、PS1基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1動物及分組 選擇9月齡(從出生前后±3 d)健康雄性SMAP8 30只，體質量 (30±2)g，購自中國生物工程研究所。按照隨機數字表法隨機分為模型組、齊墩果酸組、鹽酸多奈哌齊(安理申)組，每組10只。另取10只SAMR1作為正常組。

1.2藥物配制和干預 齊墩果酸(純度>99%，批號：110325，購自上海友思生物技術有限公司)用研缽研磨，混懸于蒸餾水中，制成5 g/L齊墩果酸懸液。齊墩果酸組給予齊墩果酸(50 mg/kg)灌胃治療，1次/d，連續灌胃4 w。安理申(批號：110507A)，購自衛材藥業有限公司。安理申用研缽研磨，混懸于蒸餾水中，制成0.13 mg/ml的溶液。安理申組給予等量安理申溶液(1.3 mg/kg)灌胃。模型組與正常組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.3儀器和試劑 全自動多功能顯微鏡(leica dm rxa2)由德國萊卡公司提供。實時定量聚合酶鏈反應(Real time PCR)試劑如 Oligo dT、dNTP、RNA 抑制酶購自寶生物工程(大連)有限公司；逆轉錄酶、GoTaqGreen Master mix 購自美國Promega公司；Quanti Tect TM SYBR Green PCR Kit購自美國QIAGEN公司；PS1和β-actin Taqman 引物由上海生物工程有限公司合成。實時定量PCR儀(RG-3000)，Rotor-Gene生產；PCR儀〔TC-96/g/h(b)〕杭州博日科技有限公司生產。

1.4海馬區神經元光鏡檢測 各組小鼠快速斷頭取腦固定，修塊后浸入PBS，脫水包埋后切片，厚度10 μm，烘干8 h以上進行HE染色，將切片置于光鏡下觀察海馬區神經元。

1.5聚合酶鏈反應(PCR)檢測 采用異硫氰酸胍、酚和氯仿抽提法提取組織總RNA。在逆轉錄反應體系中按照試劑盒說明進行逆轉錄反應，PCR 擴增參照試劑盒說明，引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性15 min，94℃變性20 s，59 ℃退火加延伸20 s，40個循環。

表1 引物序列

2 結 果

圖1 各組小鼠海馬DG區神經元形態學觀察(HE，×40)

2.1光鏡下觀察海馬神經元形態學變化 圖1可見，R1組可見神經元輪廓清楚，突出明顯，核漿比值大，細胞核為圓形或橢圓形，著色均勻為淺藍紫色，可見深染的核仁。模型組：全部神經細胞胞體縮小，胞質濃縮，核固縮，整個細胞深染成紅色，看不到形態正常的神經元。安理申組：一部分神經細胞胞體縮小，胞質濃縮，核固縮，可見部分形態正常的神經元；齊墩果酸組：小部分神經細胞胞體縮小，胞質濃縮，核固縮，大部分神經元細胞胞體正常，胞質完好。

2.2RT-PCR法檢測APP基因的表達 模型組(1.00±0.00)與正常組(0.37±0.01)相比，APP基因的升高有統計學意義(P<0.05)。齊墩果酸組(0.41±0.06)與模型組相比，APP基因表達量有統計學意義(P<0.05)。安理申組(0.94±0.10)與模型組相比，APP基因表達量的降低無統計學意義(P>0.05)。

2.3PT-PCR法檢測PS1基因的表達 模型組(1.00±0.00)與正常組(0.50±0.02)相比，PS1基因的升高有統計學意義(P<0.05)。齊墩果酸組(0.55±0.05)與模型組相比，PS1基因表達量的降低有統計學意義(P<0.05)。安理申組(0.92±0.08)與模型組相比，PS1基因表達量的降低無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

腎中精氣的盛衰嚴重影響到腦的認知功能。腎精充足，髓海有余，腦主智能活動的功能才能充分發揮。反之，腎精虧虛，髓海失養，則見記憶力減退，智能障礙〔3〕。因此AD病變雖然在腦，但是病源在腎精不足。而采用“補腎生精”的方法治療“癡呆”、“善忘”這類疾病，在延緩和控制疾病的發展上確有療效〔4〕。

女貞子味甘苦、性涼，歸肝腎經，具有滋補肝腎、益陰養血之功，是滋補肝腎之良藥，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白、目暗不明等癥。齊墩果酸是女貞子的主要有效成分，屬于不飽和三萜化合物。具有護肝、解毒，降糖、降脂，調節免疫和抗氧化的作用〔5〕，對谷氨酸誘導的海馬神經元損傷有一定的保護作用〔6〕。本研究結果也證實了齊墩果酸組有激活神經元細胞的趨勢，并且優于西藥安理申組，說明了Aβ級聯假說認為，Aβ是AD發病的核心環節，其異常分泌和產生過多導致在特定腦區內聚集，引發相應的神經毒性作用，造成突觸損傷，神經元死亡〔7〕。目前普遍認為聚集狀的Aβ即Aβ1～42具有更強的毒性，且更容易聚集，從而形成Aβ沉淀的核心，引發神經毒性作用〔8〕。PS1基因突變可以導致Aβ1～42/Aβ1～40比例增加，使Aβ毒性增強〔9〕。反之，PS1基因的減少可以一定程度上使Aβ1～42減少，進而降低 Aβ的毒性。本研究發現齊墩果酸對SAMP8海馬DG區神經元有保護作用；而且齊墩果酸可下調SAMP8海馬組織內APP及PS1基因的表達。因此推測補腎中藥女貞子可能通過下調海馬組織APP及PS1基因的表達，抑制Aβ形成，保護神經元，進而起到防治AD的作用。

4 參考文獻

1Von Bernhardi R，Eugenin J.Alzheimer′s disease：redox dysregulation as a common denominator for diverse pathogenic mechanisms〔J〕.Antioxid Redox Signal，2012；16(9)：974-1031.

2張連城，張玉蓮，張 權.從腎藏精論治老年癡呆〔J〕.中醫雜志，2011；17(52)：1456-8.

3潘 婕，張玉蓮，張連城.從腎精與腦髓之關系論治老年癡呆〔J〕.遼寧中醫雜志，2013；10(40)：2031-2.

4黎巍威，王學美.中醫從“腎”防治阿爾茨海默病的現代研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2010；16(13)：227-31.

5盧曉沅，陳志良，王春霞.女貞子化學成分及其藥理作用研究概況〔J〕.中藥材，2006；6(10)：15-8.

6宋小丹，馬海明，韓思瑩，等.齊墩果酸對谷氨酸誘導神經細胞損傷的影響〔J〕.哈爾濱醫科大學學報，2007；57(1)：13-5.

7Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics 〔J〕.Science，2002；297(5580)：353-6.

8鄭嵋戈，阮志剛，劉 靖，等.β-淀粉樣蛋白的代謝機制〔J〕.神經解剖學雜志，2011；27(3)：344-8.

9李 拓，趙忠新.β-淀粉樣肽與阿爾茨海默病〔J〕.第二軍醫大學學報，2010；31(10)：1133-7.