改良液氮凍傷法建立易損動脈粥樣硬化斑塊模型

王雙雙 王麗麗 楊升華 孔根現 蔣知新

(南方醫科大學研究生學院，廣東 廣州 510515)

在前期工作中，本課題組通過液氮凍傷術結合高脂飲食喂養成功創建了一種操作簡單、動物死亡率低、成模滿意的與人類斑塊相似的動脈粥樣硬化(AS)易損/破裂斑塊(VP)及血栓模型〔1〕。但在后期實驗中發現，該方法高脂飲食飼養時間長(10～12 w達到肉眼明顯斑塊)，易造成動物疾病與死亡。本實驗中，對該造模方法進行改良，進一步縮短成模時間，以降低飼養成本。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級雄性新西蘭大白兔24只，體重2.25～2.5 kg，由北京綠洲動物中心提供〔許可證號：SCXK(京)2009-0013〕。

1.2試劑與儀器 高敏C反應蛋白(hs-CRP)酶聯管免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海藍基科技有限公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-1單克隆抗體及SP超敏試劑盒購自北京冰達生物科技有限公司；高脂飼料(含1% 膽固醇、3%大油、15% 蛋黃和81% 普通飼料)購自北京科澳協力飼料有限公司〔許可證號: SCXK(京)2005- 0007〕；全自動生化分析儀DXC800購自美國貝克曼公司。

1.3方法

1.3.1兔頸動脈內膜液氮凍傷術 參照文獻〔1〕，兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，無菌條件下作頸正中切口，分離右頸總動脈，兩端以動脈夾阻斷血流，24號靜脈留置針45傾斜刺入右頸總動脈，刺入后抽出針芯，生理鹽水沖洗置換出血管內的血液后抽空血管腔。無菌注射器抽取液氮快速注入右頸總動脈，重復3～5次，每次向外抽出少量靜脈留置針管以更換凍傷部位，歷時約3 min以造成血管內皮凍傷，放開動脈夾恢復血流，壓迫止血，3 d內常規使用抗生素預防感染。

1.3.2動物分組與喂養 24只兔以普通飼料適應性喂養3 d，隨機分為兩組：改良方法組(A組)和傳統方法組(B組)各12只。A 組兔首先高脂飼料喂養1 d，然后實施右頸總動脈內膜液氮凍傷術，術后高脂飼料繼續喂養；B 組兔子首先進行液氮凍傷術然后給予高脂飼料繼續喂養。6 w末每組各隨機取4只兔子頸動脈觀察斑塊形成情況(A1組及B1組)。A組剩余動物(A2組)給予液氮激發術。B組剩余動物(B2組)繼續高脂飼料喂養至10 w末，并給予液氮激發術。液氮激發術后48 h處死所有兔子，留取雙側頸動脈血管。所有兔子均自由飲水，按清潔級動物單籠喂養。

1.3.3血液生化檢測 分別于高脂喂養0、3 d、1、2、4、6及10 w耳緣抽取空腹靜脈血2 ml，并于二次液氮激發術前后經耳緣靜脈抽取空腹血2 ml，離心取上清液，于-80℃冰箱內保存待測，部分用于檢測甘油三酯(TG) 、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平，部分采用ELISA法檢測兔血清hs-CRP水平。

1.3.4病理形態學觀察 以過量戊巴比妥鈉處死兔子，取出右側頸總動脈約3.0 cm，縱行剖開，生理鹽水輕輕沖洗干凈后，觀察斑塊大小及斑塊破裂及血栓形成情況。以10%中性福爾馬林溶液固定48 h，常規石蠟包埋，血管橫截面作4 μm 連續切片，分別做HE染色及免疫組織化學染色，光鏡觀察斑塊的組織結構及斑塊部位MMP-1蛋白的局部表達情況。免疫組化采用SP法，DAB 顯色，棕黃色顆粒狀產物為陽性標記，并設陰性對照(以PBS 代替一抗)，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0 軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1一般情況 B組3只動物出現下肢壞疽，其中1只治療后壞疽得到控制，2只死亡；一只出現耳螨，治療后好轉；共22只兔子完成實驗。

2.2血脂變化 高脂飼料喂養3 d后TG、TC及LDL均出現明顯增高，第1周內升高幅度最大，第2～10周血脂緩慢增高。與基線血脂水平相比，高脂飼料喂養后3 d、1、2、4、6及10 w的血清TG、TC及LDL均有明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3血清hs-CRP水平變化 與實驗前相比，高脂喂養1 w后兩組兔血漿hs-CRP即明顯升高，至激發前進一步升高，激發后hs-CRP較激發前明顯升高(P<0.05)。各時間點兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.4病理形態學觀察

2.4.1肉眼大體觀察 B1組兔右頸總動脈輕度僵硬，未見明顯串珠樣改變，管腔內膜較光滑，肉眼見少量脂樣物質沉積，但無明顯斑塊樣隆起。A組及B2組兔右頸總動脈管壁明顯僵硬，粗細不均，呈串珠樣突出外膜，內膜面見大量黃白色脂樣物質向管腔突出，并連成片狀。

2.4.2光鏡觀察 圖1可見，A1組可見血管壁內明顯向管腔內突出的斑塊形成。內皮細胞較完整，斑塊內含有大量的泡沫細胞和平滑肌細胞，中膜明顯萎縮，平滑肌細胞排列紊亂，呈典型的成熟AS斑塊。B1組兔頸總動脈內皮細胞較完整，血管內膜輕度增生，內膜可見少量脂質沉積，少部分內膜可見突出斑塊，但斑塊面積明顯小于A1組。A2組及B2組可見血管內膜脫落，斑塊脂質核心較大(或壞死)，有大量炎癥細胞(如巨噬細胞和淋巴細胞等)浸潤，細胞外基質較少，纖維帽較薄。

表1 高脂飼料喂養后不同時間血脂變化(mmol/L，±s)

圖1 各組不同時期頸動脈斑塊形態(HE，×100)

2.4.3免疫組織化學檢測 A1組及B1組斑塊處有MMP-1的局部表達，而A2組及B2組斑塊處均有MMP-1蛋白的大量表達。其中MMP-1陽性細胞主要位于斑塊纖維帽及肩部，斑塊內部也有其大量表達(圖2)。

表2 不同時間點血清hs-CRP的變化(ng/ml，±s)

圖2 各組頸動脈斑塊MMP1的表達水平(免疫組化法，×100)

3 討 論

AS斑塊的破裂和繼發血栓形成是急性心血管事件的主要病因〔2〕。VP的早期識別和干預對于急性心血管事件的預防具有十分重要的意義。

本實驗結果提示，A1組的動物在高脂飲食6 w即已形成明顯頸動脈斑塊，內膜大量黃色脂質物沉積，病理觀察呈典型的成熟動脈粥樣硬化斑塊。B1組高脂飲食6 w時可見頸動脈內膜有少量脂質物沉積，病理切片見血管內粥樣斑塊面積較小。其出現明顯差別的原因可能為A1組液氮凍傷損傷血管內膜前動物體內血脂已經達到較高水平，其中TC、LDL升高達基線水平的10余倍，血管局部可能已有脂質沉積。液氮凍傷后，損傷的內皮細胞釋放大量細胞因子和趨化因子，招募單核-巨噬細胞在局部聚集吞噬大量脂質形成泡沫細胞。進一步放大局部炎性及吞噬反應，促使AS斑塊形成。而在實驗中觀察到B1組動物液氮凍傷后3 d內進食量減少(考慮與頸部傷口疼痛及飼料更換有關)，血脂水平無法迅速升高，而血管內膜損傷后可自我修復，致使內膜損傷和損傷處脂質沉積過程不同步，可能致使斑塊形成速度較慢。但是B2組動物證明，延長高脂飲食時間也可導致AS斑塊形成。研究表明單純的高脂飼料喂養也可導致動物體內炎性因子如C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α等增加〔3〕，本實驗也驗證了這種結果。炎性因子的增加可損傷血管內皮細胞。A組先給予高脂喂養，不但更有利于液氮凍傷術后血管內膜損傷處脂質沉積；也可使體內炎性因子增加，放大并延續液氮損傷術對內膜的損傷作用，使脂質沉積加快，更易形成斑塊內較大的脂質核心，有利于不穩定斑塊模型的制作。另外，改良方法造模時間相對較短，血管平滑肌分泌膠原含量相對較少，斑塊纖維帽相對較薄，更利于制作不穩定斑塊模型。而適當縮短高脂喂養時間也可避免斑塊過大，使其更接近不穩定斑塊的形態和結構。

斑塊內炎癥是引起斑塊不穩定的關鍵因素〔4〕。本實驗結果提示，二次液氮凍傷后，由于內皮損傷、斑塊破裂，導致斑塊內大量炎性細胞通過黏附分子和化學趨化因子被募集到斑塊中并且在氧化脂質、細胞因子等作用下被激活，合成分泌大量的炎性因子(如白細胞介素類，TNF-α)和基質金屬蛋白酶(MMPs)，前者促進炎癥反應，后者主要降解細胞外基質，使斑塊內膠原、彈性蛋白含量較少，從而增加斑塊的不穩定性〔5〕。國內外研究表明MMP-1與AS斑塊破裂之間存在明顯的正相關關系，即MMP-1含量越高之處，斑塊越易破裂〔6〕。本實驗結果提示改良方法傳統方法制作的VP與人體內易損斑塊MMP-1的變化趨勢相同。

另外，在液氮凍傷術采用的器械方面，本實驗也進行了調整。前期試驗采用1 ml針頭刺入血管進行液氮凍傷操作，在二次液氮激發術時，由于血管內已經形成較大斑塊，針頭刺入后極易損傷斑塊，造成斑塊器械性破壞，損傷標本。本實驗采用24號靜脈留置針，雖然針孔較大，需更長時間的按壓止血，但是血管內斑塊不易被損傷，保證了二次液氮凍傷激發斑塊破裂的可靠性。

4 參考文獻

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