慢性阻塞性肺疾病患者誘導痰內樹突細胞及趨化因子受體6水平與FEV1%的相關性

符丹丹 歐陽瑤 薛令合

(遵義醫學院附屬醫院呼吸一科,貴州 遵義 563000)

慢性阻塞性肺病(COPD)發病機制與患者氣管或支氣管的炎癥反應聯系緊密〔1〕。在氣道的炎癥反應里，CC趨化因子配體(CCL)20可發揮介導樹突細胞(DCs)的遷徙成熟，同時聚集在氣道的上皮黏膜等作用。而CCR6是CCL20的相關受體，通常表達于并未成熟的DCs，能夠趨化表達機體CCR6的細胞朝抗原產生的組織部位進行定向遷徙〔2〕。本文將CD40和CD86作為DCs的有關表面標志，探討其與第1秒用力呼氣容積(FEV1)占預計值百分比(FEV1%)的相關性。

1 資料和方法

1.1臨床資料 選擇2008年1月到2009年3月在我院進行住院治療的患者51例作為研究對象，男42例，女9例，年齡60～86〔平均(72.3±2.4)〕歲。參考《根據2007版COPD全球倡議(GOLD)評價》〔3〕將患者依照病情的輕重程度分為無吸煙組5例，年齡60～81〔平均(71.9±1.9)〕歲；吸煙但無COPD組5例，年齡60～80〔平均(71.7±2.2)歲；GOLDⅠ組11例，年齡61～79〔平均(68.9±7.4)〕歲；GOLDⅡ組17例，年齡62～78〔平均(68.7±6.3)〕歲。GOLDⅢ～Ⅳ組13例，年齡60～77〔平均(72.9±6.5)〕歲?；颊呷朐寒斕旒纯刹杉瘮祿Y料，并對COPD患者的疾病嚴重程度實施臨床評估。

1.2研究方法

1.2.1指標檢測 主要試劑：(1)美國BD公司的抗人CD40的單抗-PE標記；(2)美國BD公司的抗人CD86的單抗-異硫氰酸熒光素(FITC)標記；(3)上海銳通公司和美國IND公司的CCR6試劑盒。經氧氣霧化吸入法對受試者誘導痰進行收集，選擇改良pin法和常用梯度的高滲鹽水法。其中試劑配制為3%和4%以及5%的高滲鹽水，0.1%二硫蘇糖醇(DTT)。

1.2.2痰液處理 (1)稱重痰液，加進2倍體積0.1%DTT混合均勻，并置于漩渦振蕩器內混勻；(2)放置在37℃的恒溫水浴箱內孵育和振蕩約30 min，而后加入和DTT相等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)液，水浴震蕩約5 min；(3)稀釋痰液通過四層的無菌紗布進行過濾，將濾液置入離心機內經1 000 r/min離心約10 min，而后取上清液，放入-80℃的冰箱內保存；(4)將細胞層(沉淀)以D-PBS重懸，經300目的尼龍網過濾，以1 000 r/min離心10 min，2次，吸管吸除上清液；(5)將沉淀經D-PBS重懸，于顯微鏡下將細胞數調至1×106/ml；(6)加入到2個流式細胞儀的專用試管中，將其中的一個管作自身對照管，另一管則加進鼠抗人CD40，PE 5 μl以及鼠抗人CD86，FITC 5 μl用作待測的標本管，在加進試劑的同時漩渦混勻；(7)在室溫下避光孵育約30 min，并用尼龍網過濾，在4℃的避光條件下經流式細胞儀測定；(8)將上清液在ELISA實驗之前1 d置入密封的冷凍干燥機中實施樣本濃縮約12 h，最后取出解凍備用。

2 結 果

2.1各組患者肺功能情況對比 GOLD Ⅰ組和GOLD Ⅱ組及GOLD Ⅲ～Ⅳ組的FEV1%，FEV1/用力肺活量(FVC)均顯著低于無吸煙組以及吸煙但無COPD組；GOLD Ⅱ組和GOLD Ⅲ～Ⅳ組的FEV1%與FEV1/FVC水平亦分別顯著低于GOLD Ⅰ組水平；GOLD Ⅲ～Ⅳ組的FEV1%與FEV1/FVC水平顯著低于GOLD Ⅱ組水平(均P<0.05)。見表1。

表1 各組患者肺功能情況對比±s)

2.2各組患者痰CD40、CD86及CCR6水平對比 GOLD Ⅰ組和GOLD Ⅱ組及GOLD Ⅲ～Ⅳ組的CD40、CD86、CCR6均顯著高于無吸煙組以及吸煙但無COPD組；GOLD Ⅱ組和GOLD Ⅲ～Ⅳ組的CD40與CD86，以及CCR6水平亦分別顯著高于GOLD Ⅰ組水平；GOLD Ⅲ～Ⅳ組的CD40、CD86、CCR6水平顯著高于GOLD Ⅱ組水平(均P<0.05)。見表2。

表2 各組患者痰CD40、CD86及CCR6水平對比±s，pg/ml)

2.3DCs、CCR6與FEV1%的相關性分析 DCs與FEV1%呈負相關關系(r=-0.913，P=0.000)，CCR6與FEV1%呈負相關(r=-0.892，P=0.000)。

3 討 論

本文表明伴隨COPD癥狀嚴重程度的增加，患者肺功能逐漸惡化，符合苗麗君等〔4〕報道結果，也符合臨床COPD患者的實際情況。而CCR6含量較無吸煙的健康對照組以及吸煙但無COPD組而言，在氣道內有顯著上升的趨勢〔5〕。此結果符合羅紅艷等〔6〕的報道，此前的研究表明，CCL20在COPD的誘導痰內有顯著增加，并結合機體CCL20/CCR6具有的抗原提呈效果，同時CCR6又在未成熟的DCs內表達，而DCs水平的增加又可說明CCR6/CCL20間的相互作用有著較為強大的趨化作用〔7〕。這同時也提示CCL20參與到患者COPD氣道炎癥時，CCR6亦發揮較為重要的作用，與DCs參與到COPD發病過程有一定聯系。有報道稱〔8〕，DCs水平在COPD患者機體中的數目有所增大，同時主要表現在直徑<2 mm的小氣道DCs數目變多。雖然臨床上亦有相反結論，但總體而言，大都支持長期吸煙可降低DCs成熟及相應功能，同時增大肺部的反復感染機會及惡化頻率，從而加速患者COPD的進程這一結論〔9〕。此外，DCs與FEV1%呈負相關關系，CCR6與FEV1%呈負相關，與劉輝國等〔10〕報道一致，表明DCs及CCR6與患者肺功能水平的變化密切相關。CCR6主要表達在未成熟DCs之上，是一類趨化因子受體，其對于DCs募集和趨化過程而言，能夠發揮關鍵作用。CCR6具有的特殊性決定了其僅可和配體CCL20進行結合，形成CCR6/CCL20〔11〕。一項分離肺部DCs的研究發現，其中的確存在CCR6水平的表達，證實機體肺部確實也存在CCR6/CCL20。本次研究選擇的COPD患者普遍為長期大量的吸煙人群(人均>400年支)，國外有研究發現存在吸煙病史的COPD患者其誘導痰內CD40及CD86表達和CCR6水平均顯著上升，充分表明DCs和CCR6在患者的氣道浸潤中顯著增加〔12〕。正常未吸煙者DCs數量和CCR6含量和吸煙無COPD患者相比，差異并不顯著，這其中的原因可能是和本次研究選擇的樣本量較少，同時吸煙無COPD者吸煙指數相對較低等因素有關〔13，14〕。所以，無吸煙者和吸煙但無COPD的DCs數量和CCR6含量水平是否差異不顯著，值得臨床深入研究。

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