運動與肉堿補充對肝臟膽固醇代謝的影響

， ，

(1.南京體育學院 運動健康科學系， 江蘇 南京 210014;2.南京體育學院 南京大學運動生物醫學聯合實驗室， 江蘇 南京 210014)

運動與肉堿補充對肝臟膽固醇代謝的影響

劉秀娟1,2，王斌1,2，張蘊琨1

(1.南京體育學院 運動健康科學系， 江蘇 南京 210014;2.南京體育學院 南京大學運動生物醫學聯合實驗室， 江蘇 南京 210014)

目的：探討運動與肉堿補充對肝臟膽固醇代謝的影響。方法：通過飼喂高脂日糧將C57BL/6小鼠建立營養性肥胖模型。隨機分為4組:對照組、運動組、左旋肉堿組及運動結合左旋肉堿組。5周后采集血液、肝臟組織，檢測血清和肝臟中的膽固醇水平及膽固醇代謝關鍵基因3-羥-3-甲基戊二酸單酰CoA還原酶(HMGCR)、肝臟X受體(LXR)和固醇調節元件結合蛋白2(SREBP2)的基因表達。結果：無論是運動還是左旋肉堿補充均使肥胖小鼠體重顯著降低，而運動跟肉堿同時處理對體重的影響更大。運動顯著增高血清中總膽固醇(Tch)的水平(P<0.05)，并且顯著增高低密度脂蛋白(LDL)的水平(P< 0.05)。運動與肉堿同時處理顯著增高血清高密度脂蛋白(HDL)的水平(P<0.05)。運動及運動與肉堿同時處理均顯著上調膽固醇合成的限速酶——HMGCR的蛋白表達(P< 0.05)，并且與單純肉堿組相比，運動對HMGCR的蛋白表達有上調的趨勢(P= 0.073)。運動與肉堿同時處理顯著上調LXR和SREBP2的基因表達(P<0.05)。結論：運動結合左旋肉堿補充通過刺激HMGCR、LXR和SREBP2的表達上調HDL的水平，運動主要通過HMGCR調節膽固醇及脂蛋白的代謝，而單純左旋肉堿補充對膽固醇代謝沒有顯著影響。

運動；左旋肉堿；肥胖；肝臟；膽固醇

隨著經濟發展和科技水平地提高，人們的運動量大幅降低，同時生活節奏加快，快餐及高脂飲食等不健康的生活方式日益呈現，導致超重人口比例增加，其中少年及中老年人群尤為突出。肝臟作為脂肪代謝的主要器官，其對脂肪的代謝能力尤為重要。在脂肪分解代謝的過程中，脂肪酸只有進入線粒體才能完全被氧化分解供能，而左旋肉堿是脂肪酸進入線粒體的載體，如果缺乏左旋肉堿就會限制脂肪酸進入線粒體的量，從而影響脂肪的分解。

左旋肉堿(L-carnitine)，又稱L-肉堿，是一種促使脂肪轉化為能量的類氨基酸，其主要生理功能是促進脂肪酸進入線粒體進行氧化分解。研究證實，服用左旋肉堿能夠在減少身體脂肪、降低體重的同時，不減少水分和肌肉。肝臟是脂類的重要代謝器官，當體內缺乏左旋肉堿或甲基供應不足時，會引起長鏈脂肪酸氧化發生障礙，導致脂肪在肝中過量存積而發生脂肪肝。近年來人們對左旋肉堿的研究很多，增加或補給左旋肉堿的攝入量，可調節脂肪代謝，促進脂肪的氧化，從根本上消除體內或臟器內多余的或存積的脂肪[1-2]。脂代謝包括甘油三酯代謝、磷脂代謝、膽固醇代謝等。有關左旋肉堿對脂代謝的研究多集中在脂肪酸代謝方面，對膽固醇的研究較少。

膽固醇是類固醇激素、膽汁酸及維生素D的前體，同時又是細胞生物膜的組成成分，對機體生命活動具有重要意義。對于大多數組織來說，保證膽固醇的供給，維持機體膽固醇的穩態十分重要。機體膽固醇代謝異常會增加人類心血管疾病的易感性，影響生長發育和健康狀態[3-4]。研究表明機體膽固醇代謝紊亂，會使血漿膽固醇水平升高，長期的高膽固醇會使脂質尤其是膽固醇侵入大血管壁沉積、聚集，促使動脈內膜平滑肌細胞和纖維細胞增生，導致動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓以及腦血管疾病的發生[5-6]。

肝臟是機體膽固醇合成的主要器官，也是膽固醇轉運、分泌和轉化的場所。在膽固醇代謝過程中，許多因子參與對其調控。其中，3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR)是肝臟合成膽固醇的關鍵限速酶，而肝臟X受體(liver X receptor， LXR)參與肝臟膽固醇合成、轉運和轉化的調控，當細胞內膽固醇含量高時，會刺激LXR表達，LXR會上調其下游靶基因，從而促進膽固醇流出細胞和高密度脂蛋白的合成[7-8]。LXR還可以激活脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶等的活性，促進脂肪酸和甘油三酯的合成。當細胞內膽固醇濃度較低時，膽固醇調節元件結合蛋白2(Sterol regulator element-binding protein-2，SREBP-2)會刺激HMGCR的表達及其活性調節，促進胞內膽固醇的合成。因此，LXR和SREBP-2是膽固醇調節的主要因子，對維持細胞的脂質穩態起重要的調控作用[9-10]。運動、左旋肉堿及二者共同作用對膽固醇代謝有何影響，對膽固醇代謝的重要調節因子LXR、SREBP-2及HMGCR有何影響尚不清楚。

本研究擬以肥胖小鼠為實驗模型，通過研究運動以及左旋肉堿補充對肥胖小鼠肝臟膽固醇代謝的影響，試圖從分子水平探討其可能的機制，以期為肥胖人群通過運動降低血漿膽固醇水平，預防高膽固醇血癥、冠心病、動脈粥樣硬化及高血壓等疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

4周齡雄性C57BL/6小鼠46只，體重18～22g，購自南京醫科大學實驗動物中心。總膽固醇(Tch)和總甘油三酯(TG)測定試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇(LDL)試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇(HDL)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。Trizol 試劑盒，購自上海英杰生物工程有限公司；反轉錄酶(M-MLV)、實時熒光定量PCR master mix (TaKaRa)、RNA酶抑制劑(RNase inhibitor)(Promega, Madison)，購自南京生興生物工程有限公司；隨機引物(Random hexamer primers)，購自南京生興生物工程有限公司；目的基因引物由上海英駿生物技術有限公司合成。BCA總蛋白測定試劑盒(Pierce，USA)，兔抗HMGCR多克隆抗體(Santa cruz, USA)，鼠抗β-actin多克隆抗體(Abcam, USA)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(優寧維)，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(優寧維)，ECL化學發光試劑盒(Super Signal West Pico Trial Kit)，均購自南京生興生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理

隨機選取10只小鼠喂養普通飼料，另外36只建立營養性肥胖小鼠模型，喂食高脂飼料，建立營養性肥胖模型。實驗期間小鼠自由攝食和飲水，自由活動，自然采光。建模成功后將小鼠隨機分為4組。

分組設計：36只肥胖小鼠隨機分為4組(表1)，每組9只(n=9)動物分籠飼養，每籠1只，自由進食飲水，室溫，相對濕度控制在40%～60%，自然采光。E組和E+L組的運動采用為期6周的游泳訓練，1次/天，60分/次，5天/周。

表1 實驗動物分組方案

建模成功后，采用500 mg/Kg·BW的劑量添加L-carnitine的自制鼠糧飼喂小鼠，L組和E+L組小鼠每次在訓練前1小時分籠飼喂。

最后一次游泳訓練，稱重，訓練后，吹干被毛，處死取樣。

1.2.2 血清中TG、Tch、HDL、LDL的測定

參照試劑盒說明書用酶標儀測定。

1.2.3 肝臟膽固醇代謝的相關基因檢測

肝臟總RNA用Trizol試劑盒提取。提取的總RNA用Nano Drop分光光度計 (ND-2000)測定總RNA濃度和純度(OD260/OD280 = 1.8～2.0)。取4 μg總RNA，1.4%瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳分離，EB染色后，用Kodak 1D電泳凝膠成像系統分析RNA條帶。

用隨機引物對所有樣品的RNA進行RT，獲得各樣品RNA的cDNA(RT產物)。RT反應總體積25 μL，包括2 μg總RNA， 隨機引物，0.8 mmol/L dNTP，加DEPC 水至10 μL，70°C變性5 min，立即置于冰上冷卻，再加8 U RNA酶抑制劑，100 U M-MLV反轉錄酶，5 μL 5×RT buffer，補充DEPC處理水補齊至25 μL，37°C反應60 min，95°C滅活5 min。同時用無反轉錄酶的反轉錄體系對總RNA的混合樣進行反轉錄，用于檢測總RNA樣品中是否有基因組DNA污染。RT產物保存在-20°C用于PCR檢測。

ACTIN和目的基因根據GenBank上小鼠的相關 cDNA序列設計，由英駿生物技術有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列

試驗采用實時熒光定量PCR(Real time quantitative PCR)對目的基因的表達進行相對定量，用2-ΔΔCT法對有效性數據進行統計分析，以相當于對照(Calibrator)的倍數做圖。ΔΔCT表示目標基因與選擇ACTIN為內標基因的Ct差值和以對照組的目標基因和內標基因Ct差值的平均值為參照，x表示任意一個樣本，公式如下：

ΔΔCT=( CT.Target-CT.ACTIN)X- (CT.Target-CT.ACTIN)control

通過上述公式計算出每一個樣本目標基因的表達，通過ACTIN校正后相對于對照組的目標基因表達的倍數。

1.2.4 蛋白檢測

取肝臟組織100 mg左右，加裂解液1：8(w/v)，冰浴勻漿，冰上放置30 min， 4°C，5000 r/min離心10 min，吸上清，BCA法測定蛋白濃度。

配制10% SDS-PAGE分離膠，4%濃縮膠。以30 μg蛋白樣品量進行上樣,轉印，一抗、二抗孵育，化學發光檢測。

1.2.5 數據分析及統計

試驗結果用Means ± S.E.M.表示，統計分析采用SPSS軟件(For Windows Version 20.0)，差異顯著性檢驗采用單因素ANOVA分析方法，P<0.05為差異顯著，P< 0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 運動及左旋肉堿補充對肥胖小鼠體重、肝臟重的影響

由圖1可以看出，運動3周后，運動組、左旋肉堿補充組及運動結合左旋肉堿補充組小鼠的體重與對照組相比均出現顯著降低(P<0.05)，并且在隨后的時間里這一效果持續存在。提示運動和左旋肉堿補充均可以顯著降低肥胖小鼠的體重(P<0.05)，且二者同時干預效果更好。

圖1 肥胖小鼠體重的變化

2.2 運動及左旋肉堿補充對肥胖小鼠肝臟重量的影響

圖2 小鼠肝臟重量的變化

由圖2可以看出，運動5周后，與肉堿組相比，運動組小鼠肝臟的重量明顯升高(P<0.05)，而運動結合肉堿補充組較運動組小鼠肝臟的重量顯著降低(P<0.05)，單純肉堿補充對小鼠肝臟重量無顯著影響。

2.3 運動及左旋肉堿補充對肥胖小鼠肝臟和血清中TG、Tch、HDL、LDL的影響

由表3可以看出，與肉堿組相比，運動顯著增高了血清中膽固醇的含量(P<0.05)，并且極顯著的增加了血清低密度脂蛋白的水平(P<0.01)，且與對照組相比，運動也顯著升高了血清低密度脂蛋白的水平(P<0.05)。與肉堿組相比，運動和左旋肉堿補充顯著升高了血清中的高密度脂蛋白的水平(P<0.05)。

表3 肥胖小鼠血清和肝臟中的膽固醇含量

2.4 運動及左旋肉堿補充對肥胖小鼠肝臟3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)的影響

圖3結果顯示，與對照組相比，運動及運動與左旋肉堿補充同時處理均顯著上調HMGCR蛋白的表達(P<0.05)，與肉堿組相比，運動對HMGCR的表達有上調的趨勢(P = 0.073)。

圖3 運動及左旋肉堿對HMGCR的影響

2.5 運動及左旋肉堿補充對肥胖小鼠肝臟X受體(LXR)表達的影響

圖4結果顯示，無論與對照組比，還是與運動組比、肉堿補充相比，運動和肉堿同時處理均極顯著升高LXR的基因表達(P<0.01)，而單純運動或單純左旋肉堿補充對LXR的基因表達均無顯著影響。

圖4 運動及左旋肉堿對LXR基因表達的影響

2.6 運動及左旋肉堿補充對肥胖小鼠肝臟SREBP2表達的影響

圖5 運動及左旋肉堿對SREBP2基因表達的影響

圖5結果顯示，與肉堿補充相比，運動和肉堿同時處理極顯著升高SREBP2的基因表達(P<0.05)，而單純運動或單純左旋肉堿補充對SREBP2的基因表達均無顯著影響。

3 討論

隨著人們生活水平提高，工作壓力增大，運動時間減少，超重人群的比例日漸升高，主要原因是由日常脂肪攝入量過高，缺乏鍛煉等造成的。肝臟作為脂肪代謝的主要器官，其對脂肪的代謝能力非常重要；而脂代謝包括甘油三酯代謝、磷脂代謝、膽固醇代謝等。一些研究關注單獨運動、單獨左旋肉堿或二者兼有對脂代謝的影響，但多集中在甘油三酯代謝方面，很少提及膽固醇代謝，而運動結合左旋肉堿補充對膽固醇代謝的影響少見報道。

左旋肉堿是人體長鏈脂肪酸進入線粒體氧化功能所必需的因子，而運動是人們公認的健身減肥手段，因此我們將二者結合，研究其在膽固醇代謝中的作用。結果顯示，對于高脂飲食誘導的肥胖小鼠進行持續5周的訓練其體重顯著低于對照組，左旋肉堿補充也顯著降低了肥胖小鼠的體重，運動和左旋肉堿補充同時干預對體重的影響效果更好，提示對于高脂飲食誘導的肥胖，無論運動還是肉堿補充均對減重很有幫助，且二者同時干預效果更佳。此外在減重的同時，并不影響肝臟的重量，運動反而可以增加肝臟的重量。對肝臟膽固醇水平的檢測顯示，運動及肉堿均未改變高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟的膽固醇水平。有研究顯示有氧運動可以阻止高脂飲食誘導的膽固醇水平的升高[11]，這與我們的結果相符，并且進行為期5周的正常日糧飼喂及運動或肉堿干預，肝臟的高膽固醇水平降為正常水平也在意料之中。

對血清指標的研究顯示，與肉堿組相比，運動顯著上調了血清總膽固醇的水平，運動與肉堿同時處理顯著上調血清高密度脂蛋白的水平，由于高密度脂蛋白是參與膽固醇逆向轉運的主要物質，提示運動可能通過增加膽固醇的流出、上調高密度脂蛋白、增加膽固醇的清除，從而改善肝臟脂代謝[12]。而左旋肉堿補充對血脂并無顯著影響。有關左旋肉堿補充對血脂水平的影響不同研究結果存在不同。占秀安等研究顯示，左旋肉堿補充可以顯著降低血清甘油三酯的水平，這與我們的結果不相符，可能是由于實驗動物的模型不同所致[13]。同樣，周斅激等對肥胖女性的研究結果也發現左旋肉堿補充可以降低血脂水平[14]，范雪等研究報道，左旋肉堿補充對血脂指標沒有顯著影響，這與我們的結果相符[15]。在兩個脂肪水平下添加肉堿對魚的研究顯示，在14%脂肪組，添加肉堿影響了組織的脂肪代謝，顯著降低了體脂肪和肝脂肪含量，但這種作用在6%脂肪組不明顯，提示肉堿補充對脂代謝的影響與脂肪水平有關[16]。同時，也可能與不同實驗研究補充的劑量、持續的時間及其它干預因素相關。

由于發現運動增加了血清總膽固醇的水平，肝臟作為膽固醇代謝的主要器官，因此我們采用免疫印跡的方法檢測了膽固醇代謝的關鍵酶HMGCR的表達，并運用實時熒光PCR方法檢測了其主要的轉錄調節因子LXR和SREBP2的基因表達，結果發現運動及運動與左旋肉堿補充同時處理均顯著上調HMGCR蛋白的表達，提示運動及運動與肉堿同時處理均可提高HMGCR的含量，促進膽固醇代謝；與肉堿組相比，運動對HMGCR的表達有上調的趨勢，提示與肉堿相比，運動對膽固醇的代謝影響更大，這一結果與運動對高低密度脂蛋白的影響相吻合。對LXR及SREBP2的研究發現，運動和肉堿同時處理均極顯著升高LXR和SREBP2的基因表達，而單純運動或單純左旋肉堿補充對LXR和SREBP2的基因表達均無顯著影響。這一結果提示運動可能通過影響LXR和SREBP2的基因表達來調節膽固醇代謝關鍵限速酶HMGCR的表達影響膽固醇代謝過程，引起膽固醇的逆轉運并增加血清膽固醇的含量。從本實驗結果來看，運動結合左旋肉堿補充通過刺激HMGCR、LXR和SREBP2的表達上調HDL的水平，但可能運動對高脂飲食誘導的肥胖小鼠膽固醇代謝的影響效果更佳，運動可能通過HMGCR調節膽固醇及脂蛋白的代謝，左旋肉堿補充可能更傾向于影響其他脂質代謝。

4 結論

運動及左旋肉堿補充均可以降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體重，并且運動顯著上調高脂飲食小鼠血清總膽固醇和高密度脂蛋白的水平，運動結合左旋肉堿補充可能通過刺激LXR、SREBP2和HMGCR的表達來調節膽固醇的代謝，從而上調高密度脂蛋白的水平，運動主要通過調節HMGCR影響膽固醇代謝，而單純左旋肉堿補充對膽固醇代謝沒有顯著影響。由此提示運動可以改善由于高脂飲食誘導的肥胖人群的體重及膽固醇代謝，運動結合肉堿補充效果更好，而單純補充肉堿效果并不明顯。

[1]Kang, J.S.,etal.Improvement of high-fat diet-induced obesity by a mixture of red grape extract, soy isoflavone and L-carnitine: implications in cardiovascular and non-alcoholic fatty liver diseases[J].Food Chem Toxicol, 2011，49(9):2453-8.

[2]Mingorance, C.,etal.Propionyl-L-carnitine corrects metabolic and cardiovascular alterations in diet-induced obese mice and improves liver respiratory chain activity[J]. PLoS One, 2012，7(3):34268.

[3]Levine, G.N., J.J. Keaney and J.A. Vita, Cholesterol reduction in cardiovascular disease. Clinical benefits and possible mechanisms[J]. N Engl J Med,1995，332(8):512-21.

[4]Serao, N.V.,etal.Candidate gene expression and intramuscular fat content in pigs[J]. J Anim Breed Genet, 2011,128(1):28-34.

[5]Knopp, R.H.Drug treatment of lipid disorders[J]. N Engl J Med, 1999,341(7):498-511.

[6]Rodriguez-Sanabria, F.,etal.Differential response of two models of genetically modified mice fed with high fat and cholesterol diets: relationship to the study of non-alcoholic steatohepatitis. Mol Cell Biochem, 2010,343(1-2):59-66.

[7]Geyeregger, R., M. Zeyda and T.M. Stulnig, Liver X receptors in cardiovascular and metabolic disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2006,63(5): 524-39.

[8]van Straten, E.M.,etal.The liver X-receptor gene promoter is hypermethylated in a mouse model of prenatal protein restriction[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2010,298(2):275-82.

[9]Goldstein, J.L., R.B. Rawson and M.S. Brown.Mutant mammalian cells as tools to delineate the sterol regulatory element-binding protein pathway for feedback regulation of lipid synthesis[J].Arch Biochem Biophys, 2002,397(2):139-48.

[10]Horton, J.D., J.L. Goldstein and M.S. Brown, SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver[J].J Clin Invest, 2002,109(9):1125-31.

[11]Ortega, J.F.,etal.Increased blood cholesterol after a high saturated fat diet is prevented by aerobic exercise training[J].Appl Physiol Nutr Metab,2013,38(1):42-8.

[12]王玉, 何勇,侯一平.運動與膽固醇逆向轉運的研究[J]. 成都體育學院學報, 2005,31(2):97-100.

[13]占秀安,許梓榮.L-肉堿對肉雞腹脂沉積的影響及作用機理探討[J].中國糧油學報, 2004,19(5):75-78.

[14]周斅激.L-肉堿配合有氧運動對肥胖女性脂肪代謝的影響[J].天津體育學院學報, 2004,19(4): 60-62.

[15]范雪,嚴政.L-肉堿與有機鉻對舉重運動員脂肪控制的影響[J].南京體育學院學報(自然科學版), 2007,6(3):41-43.

[16]王驥騰,等.2個脂肪水平下添加肉堿對軍曹魚生長及體組成的影響[J]. 浙江海洋學院學報(自然科學版), 2007,26(2):125-131.

Effects of exercise and L-carnitine supplementation on cholesterol metabolism in the liver

LIU Xiu-juan1,2, WANG Bin1,2, ZHANG Yun-kun1

(1.Department of Human Sports Science, Nanjing Institute of Physical Education, Nanjing 210014,Jiangsu;2.Laboratory of Nanjing Institute of Physical Education Associated with Nanjing University in Sports Biomedicine，Nanjing 210014,Jiangsu,China)

Objective:To investigate the effects of exercise and L-carnitine supplementation on cholesterol metabolism in the liver.Methods:To establish nutritional obesity model by fedding high-fat diets to C57BL/6 mice. Obesity mice were randomly divided into 4 groups, the control group, the exercise group, fedding L-carnitine group and exercise combined L-carnitine supplementation group. 5 weeks later, mice were killed, and blood, liver tissue were collected. Lipids in serum and cholesterol metabolism key enzymes 3- hydroxy-3-methyl-glutaryl CoA reductase (HMGCR), liver X receptor (LXR) and sterol regulatory element binding protein 2 (SREBP2) in liver were tested.Results:The body weights were significantly low in 3 experiment groups (P<0.05), especially in exercise combined L-carnitine supplementation group. Total cholesterol (Tch) and low density lipoprotein (LDL) in serum were significantly increased in exercise group (P<0.05). High density lipoprotein (HDL) in serum was significantly increased in exercise combined L-carnitine supplementation group(P<0.05). The expression of cholesterol synthesis rate-limiting enzyme - HMGCR was significantly up-regulated in exercise group and in exercise combined L-carnitine supplementation group (P<0.05), and compared with fedding L-carnitine group, there was upregulated tendency of HMGCR protein expression (P=0.073) in exercise group. The expression of LXR and SREBP2 was upregulated in exercise combined L-carnitine supplementation group (P<0.05).Conclusion: Exercise combined with L-carnitine supplementary may up-regulated the concentration of HDL by stimulation expression of HMGCR, LXR and SREBP2. Exercise regulates the metabolism of cholesterol and lipoprotein mainly through LXR and SREBP2, while L-carnitine supplementation major influence HMGCR to regulate cholesterol metabolism.

exercise； L-carnitine； obesity； liver； cholesterol

2013-09-08

江蘇省高校自然科學基金面上項目(編號:13KJB180013)，江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目。

劉秀娟(1984- )，女，講師，博士，研究方向運動與物化學、運動生理學。

G804.2

A

1009-9840(2014)01-0067-05